Молочная среда. Свежее цельное или лучше обезжиренное коровье молоко - 100 мл, пенициллин и (или) стрептомицин - 0,05…0,1 г.
Молоко берут от клинически здоровых коров с отрицательными результатами исследований на туберкулез, лептоспироз, бруцеллез, а также мастит. Желательно подобрать коров, продуцирующих молоко низкой жирности, поскольку молочные жировые шарики значительно затрудняют оценку качества разбавленной спермы. Молоко обязательно прогревают на водяной бане в течение 10 мин при температуре 92…96 °C для разрушения некоторых его белков, оказывающих на спермии токсическое действие. Затем молоко процеживают через 3…4 слоя стерильной марли, охлаждают до температуры 35…39 °C и добавляют антибактериальный препарат.
Цитратно-желточная среда. Цитрат натрия трех-замещенный пятиводный - 2,32 г, свежий желток куриного яйца - 20 мл, пенициллин и (или) стрептомицин - 0,05…0,1 г, вода дистиллированная (бидистиллированная) - 80 мл.
Навеску цитрата натрия вносят в чистую стерильную колбу. Вливают в колбу прокипяченную и остуженную дистиллированную воду; фильтруют, добавляют антисептик и желток куриного яйца. Перед извлечением желтка скорлупу яйца обеззараживают при помощи бактерицидной лампы или спиртового ватного тампона.
Среды готовят непосредственно перед получением спермы. Последнюю разбавляют сразу же после оценки ее качества. Температура спермы и среды должна быть одинаковой, чтобы предупредить температурный шок спермиев. Разбавляют сперму в градуированном смесителе, при этом среду добавляют небольшими порциями. После добавления каждой порции смеситель вращают, чтобы равномерно смешать среду и сперму. Разбавленную сперму медленно охлаждают и хранят при температуре 2…5 °C до 4…5 сут. В 1-е сутки хранения оплодотворяющая способность охлажденной спермы соответствует свежеполученной, на 4-е сутки она лучше, чем замороженно-оттаянной.
Криоконсервация, или замораживание, - самый перспективный способ хранения спермы вне организма. Впервые собаку успешно осеменили замороженно-оттаянной спермой в 1969 г. в США.
Методические основы замораживания и хранения спермы собаки и быка одинаковы. Сперму разбавляют в 4…9 раз криопротекторной средой (до концентрации не менее 40…80 млн активных спермиев в 1 мл). В качестве криопротекторной среды обычно используют трис-буферный разбавитель, содержащий 20% желтка куриного яйца, 4…16% глицерина, или же лактозо(11%) - желточно(20%) - глицериновую(4…16%) среду. Сперму замораживают в ампулах объемом 1 мл, соломинках (пайеттах) объемом 0,5…1 мл или гранулах; в парах жидкого азота или на блоках твердого диоксида углерода (-79 °C) и хранят в жидком азоте (-196 °C).
Сперму размораживают на водяной бане (при температуре 38…40 °C) в течение 30 с. Активность размороженной спермы собак обычно составляет 6…7 баллов. Сперму активностью ниже 4 баллов не используют.
Результативность осеменения собак замороженно-оттаянной спермой оставляет желать лучшего, и поэтому криоконсервирование спермы собак практикуют редко. По данным Американского клуба собаководов, в период с 1981 по 1991 г. от самок, осемененных замороженно-оттаянной спермой, получили всего 240 пометов.
Способы искусственного осеменения. Самок осеменяют на 10-е и 12-е сутки после начала течки (проэструса), на 4-е и 6-е сутки половой охоты или же на 2-е и 4-е сутки после проявления преовуляторного пика ЛГ.
Как известно, продолжительность проэструса у собак может сильно варьировать, по этой причине правильно выбрать время осеменения, ориентируясь на дату начала течки, удается далеко не всегда. Из-за вариабельности овуляции нельзя быть уверенным в точности выбора и при ориентации на дату начала половой охоты. Наиболее правильно оптимальное время осеменения собак можно выбрать по дате проявления преовуляторного пика ЛГ, используя прямые и непрямые методы его определения (картина влагалищных мазков, многократные измерения концентрации прогестерона или же ЛГ в крови).
Разработано два способа искусственного осеменения собак - влагалищный и маточный.
Влагалищный способ на сегодняшний день остается основным. Самку удерживают в стоячем положении. Половые органы ее обмывают теплой водой и орошают 1%-м раствором бикарбоната натрия. По верхнему своду преддверия влагалища и влагалища вводят укороченный стерильный полистироловый катетер для осеменения коров цервикальным способом с ректальной фиксацией шейки матки. Продвижение катетера к цервикальному каналу контролируют рукой через брюшную стенку. С помощью резиновой трубочки к катетеру присоединяют стерильный одноразовый шприц со спермой. Заднюю часть тела собаки поднимают на левое бедро осеменатора, сидящего на стуле. Собаку удерживают в наклонном положении: спереди за ошейник - владелец, сзади - осеменатор. Левой рукой осеменатор удерживает самку за левое бедро, правой медленно вводит сперму из шприца во влагалище. Катетер извлекают, в преддверие и каудальную часть влагалища вводят на 10 мин большой палец для имитации "полового замка" и стимуляции антиперистальтических сокращений в матке. Наклонное положение самки при введенном в ее влагалище пальце способствует быстрому проникновению спермы в матку. По материалам японских исследователей (Tsuitsui Т. et al., 1989), уже через 2,5 мин после введения спермы в краниальную часть влагалища спермии оказываются в полости верхушки рогов матки. После осеменения собаку выгуливают 30 мин, не позволяя ей бегать, прыгать и садиться. Хорошие результаты получают при осеменении собак свежеполученной спермой. Эффективность осеменения замороженно-оттаянной спермой остается очень низкой, охлажденной - зависит от срока ее хранения.
Внутриматочный способ практикуют редко. Этот метод разработан, чтобы повысить эффективность осеменения замороженно-оттаянной спермой. В литературе описаны два нехирургических и два хирургических способа внутриматочного осеменения собак.
Нехирургический внутриматочный способ осеменения собак с помощью норвежского катетера, применяемого для осеменения лисиц, разработан в Швеции. Используют: металлический катетер длиной 20…50 см, диаметром 0,5…1мм, нейлоновую протектор-ную оболочку, одноразовый шприц на 2 мл.
Металлический катетер в нейлоновой протекторной оболочке вводят по верхнему своду влагалища в его краниальную часть. С помощью большого и указательного пальцев захватывают шейку матки и контролируют продвижение катетера до входа в церви-кальный канал. Металлический катетер выдвигают из защитной оболочки. Осторожно манипулируя катетером и шейкой матки, отыскивают вход в канал шейки матки. Цервикальный канал проходят, вращая катетер и оттягивая шейку матки назад. Длина канала шейки матки составляет всего 0,5…1 см. Сперму вводят, удостоверившись, что кончик катетера находится в теле матки. Катетер извлекают. Самке придают наклонное положение и удерживают в нем в течение 10 мин, введя во влагалище большой палец.
Недостатки способа: неприемлем для нервных и тучных собак; связан с риском травмирования и инфицирования половых органов самки; технически трудновыполним - необходимы специальная подготовка и постоянная практика. Опытный ветеринарный врач на отыскание шейки матки и введение катетера в полость тела матки затрачивает около 1 мин.
Нехирургический внутриматочный способ осеменения при помощи эндоскопа разработан в США. Используют: цистоэндоскоп диаметром 3 мм, длиной 30 см для визуализации шейки матки, пластиковый катетер для катетеризации мочевого пузыря у самцов или ангиографический катетер диаметром 3 мм.
Преимущества использования эндоскопа: инструмент для осеменения вводят в цервикальный канал под визуальным контролем, заметно снижен риск травмирования и инфицирования половых органов.
Недостатки способа: неприемлем для нервных самок и самок с длинным влагалищем; процедура внутриматочного осеменения очень сложна и трудоемка, связана с применением дорогих инструментов и необходимостью специальной предварительной подготовки.
Хирургический внутриматочный способ осеменения через разрез брюшной стенки заключается в следующем. Самок выдерживают на голодной диете 18…24 ч. Под общим наркозом фиксируют на столе в спинном положении. Крышку операционного стола переводят в наклонное положение, чтобы вызвать смещение внутренних органов вперед и облегчить процедуру обнаружения рогов матки в брюшной полости. С соблюдением правил асептики и антисептики подготавливают операционное поле и делают разрез по белой линии живота. Извлекают рога матки. При помощи шприца с иголкой в их полость вводят сперму. Брюшную стенку зашивают обычным способом.
Процедура осеменения этим способом очень проста, но трудоемка, связана с использованием общего наркоза и возможна только в условиях клиники.
Хирургический внутриматочный способ осеменения с помощью лапароскопа и специальной пипетки с игольчатым наконечником разработан в Японии (Tsuitsui Т. et al., 1989) и подробно описан (Silva L.D.М. et al., 1994). Самку выдерживают на голодной диете. Под общим наркозом фиксируют на операционном столе в наклонно-спинном положении. Вентральную поверхность живота выбривают, обрабатывают антисептиками. При помощи иглы в брюшную полость накачивают диоксид углерода. Отступив от пупка 1 см назад по белой линии, при помощи троакара сначала в брюшную полость вводят световод диаметром 8 мм, соединенный с камерой лапароскопа, и отыскивают рога матки, затем на правой стороне живота, отступив 2 см в сторону от заднебрюшной молочной железы, вводят второй троакар диаметром 5 мм. Эндоскопическими щипцами, введенными в брюшную полость через канюлю троакара, захватывают тело матки и подтягивают к вентральной поверхности брюшной стенки. Брюшную стенку и рог матки прокалывают иглой, через которую вводят внутриматочный катетер. Иглу извлекают и через катетер осеменяют самку.
Недостатки способа: очень сложен, трудоемок, связан с использованием дорогостоящей аппаратуры, малопригоден для производственного применения. При проколе брюшной стенки существует риск повреждения крупных сосудов и внутренних органов.
Глава 3. ФИЗИОЛОГИЯ И ДИАГНОСТИКА БЕРЕМЕННОСТИ
3.1. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ
Оплодотворение - процесс слияния половых клеток самца (спермия) и самки (яйцеклетки) и образования зиготы, которая обладает двойной наследственностью и дает начало новому организму.
Естественный тип осеменения собак - маточный. Во время полового акта благодаря сцеплению половых органов самца и самки, а также выделению третьей фракции спермы и антиперистальтическим сокращениям матки спермии попадают через шейку матки в ее тело и рога, где сохраняют свою оплодотворяющую способность в течение 5…6 дней. Через фистулы рогов матки спермии выделяются спустя 25…50 с после начала эякуляции второй фракции спермы. Из рогов матки к месту оплодотворения - в ампулярную часть маточных труб спермии продвигаются за счет своей способности к ориентированному движению. В маточные трубы проникает лишь ограниченное количество половых клеток самца. Их общее количество в эякуляте обычно достигает 200 млн и более. В истмической части маточных труб спермии приобретают способность к оплодотворению. Процесс функционального созревания спермиев в маточных трубах называется капацитацией. В результате так называемой акросомной реакции спермии приобретают способность к выделению из акросомы энзимов, необходимых для проникновения спермия через оболочки яйцеклетки. Длительность капацитации спермиев собаки in vivo неизвестна, in vitro - 7 ч.
В период половой охоты у самок собак обычно созревает и ову-лирует от 2 до 14 преовуляторных фолликулов. После овуляции яйцеклетки, окруженные прозрачной оболочкой и фолликулярными клетками яйценосного бугорка, вместе с фолликулярной жидкостью попадают в овариальную бурсу на воронку маточных труб. Самостоятельной подвижностью они не обладают, а транспортируются к месту оплодотворения за счет тока жидкости, создаваемого ресничками мерцательного эпителия и перистальтическими сокращениями стенок маточных труб. Ооцит второго порядка образуется не ранее чем через 48 ч после овуляции.
Процесс оплодотворения яйцеклетки происходит по типу мо-носпермии и включает в себя несколько стадий. Первая стадия характеризуется денудацией - рассеиванием клеток яйценосного бугорка. Ведущая роль при этом принадлежит ферменту акросомы гиалуронидазе. На второй стадии головка и шейка спермия проникают в цитоплазму яйцеклетки, вызывая в прозрачной и вителлиновой оболочках яйцеклетки морфофункциональные изменения, блокирующие проникновение в ооцит других спермиев. На третьей стадии образуются пронуклеусы. Пронуклеус самца активирует второе мейотическое деление ооцита и формирование про-нуклеуса самки. На четвертой стадии оба пронуклеуса сближаются и сливаются, образуя зиготу. Процесс слияния пронуклеусов называется сингамией.
Полиспермию, или оплодотворение одной яйцеклетки несколькими спермиями, у собак практически не наблюдают, но при вольном спаривании часто встречается суперфекундация - оплодотворение нескольких яйцеклеток спермиями разных самцов.
С момента оплодотворения начинается беременность.
3.2. ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ БЕРЕМЕННОСТИ
Под беременностью понимают физиологическое состояние организма самки в период плодоношения. Во время беременности из микроскопической оплодотворенной яйцеклетки развивается плод, способный к внеутробному существованию.
В практике за начало беременности принимают день проведения первого осеменения, хотя у большинства самок, осемененных на 2…4-й день половой охоты, оплодотворение яйцеклетки наступает примерно на 4…5-е сутки после вязки.
Продолжительность беременности у собак, отсчитываемая со дня первого осеменения, в среднем составляет 63 дня. Физиологический срок вынашивания плодов колеблется от 58 до 71 дня. Длительность плодоношения зависит от породы, числа плодов в матке, возраста самки, условий кормления и содержания, продолжительности периода от осеменения до овуляции, скорости созревания и старения половых клеток и др.
3.3. ПРЕНАТАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ
У плацентарных животных процесс внутриутробного развития принято условно делить на три периода: 1) начальный, или пре-имплантационный, период дробления; 2) эмбриональный, или дифференциации; 3) плодный, или роста. Между этими периодами нет четкой границы и поэтому данные литературы об их продолжительности неоднозначны.
Начальный период - это время с момента оплодотворения яйцеклетки до образования бластоцисты. Вскоре после оплодотворения зигота начинает последовательно делиться на 2, 4, 8, 16, 32 бластомера и продвигаться по маточным трубам к матке. После каждого деления бластомеры не расходятся и становятся все меньше и меньше в размере. Спустя 10…12 дней после оплодотворения на стадии 16…32 бластомеров зародыш попадает в матку, где достигает стадии морулы (64 и более бластомеров). Количество бластомеров на стадии морулы трудно точно подсчитать, и по внешнему виду зародыш напоминает тутовую ягоду. В этот период зародыш потребляет запасы питательных веществ, главным образом ооцита и отчасти трубной и маточной жидкостей. На стадии морулы между клетками бластомеров образуется полость, и зародыш переходит в следующую стадию - стадию бластоцисты. Бласто-циста представляет собой полый шар, наполненный жидкостью, снаружи покрытый прозрачной оболочкой, изнутри образованный клетками трофобласта (trophe - питание и blastos - росток) и эмбриобласта. Трофобласт обеспечивает зародыш питательным материалом и участвует в установлении связи зародыша со стенкой матки. Эмбриобласт - источник развития тела зародыша и некоторых внезародышевых оболочек. На стадии бластоцисты прозрачная оболочка яйцеклетки разрушается. Бластоцисты приобретают овальную форму, равномерно распределяются по всей длине рогов матки и прикрепляются к ее слизистой оболочке. Процесс прикрепления бластоцисты к эндометрию рогов матки называется имплантацией. У собак имплантация наступает примерно на 18-е сутки после оплодотворения.
Эмбриональный период начинается с момента имплантации. Зародыш вступает в следующую стадию развития - гаструлу. Путем деляминации (расслоения) зародышевого диска (эмбриобласта) формируются зародышевые листки - эктодерма и эндодерма. Если эти листки образовались из материала зародышевого щитка, то они называются зародышевыми, а если возникли из незародышевой зоны зародышевого диска, то незародышевыми. Эктодерма разрастается по внутренней поверхности трофобласта, эндодерма формирует первичную кишку. Мезодерма - средний зародышевый листок - образуется из материала первичной полоски, формирующей продольную ось эмбриона, вдоль которой мезодерма заполняет пространство между клетками эндо- и эктодермы. Часть мезодермы, расположенная между зародышевыми частями эндо- и эктодермы, распадается на сомиты - сегменты тела эмбриона. Несегментированная часть мезодермы в виде мешка распространяется между незародышевыми частями экто- и эндодермы. Зародышевые листки служат источником формирования тканей (гистогенез) и зачатков органов (органогенез) эмбриона и его внезародышевых оболочек и органов.
Возникшие из эмбриональных зачатков ткани и органы эмбриона начинают функционировать. Наблюдают становление внешних форм (морфогенез) и размеров эмбриона, оформляются признаки семейства. На 30-й день беременности длина эмбриона достигает 16 мм. К началу плодного периода глаза и слуховой канал у эмбриона открыты, радужная оболочка пигментирована, веки отсутствуют, конечности цилиндрической формы, зачатки пальцев лап плохо очерчены, ушную раковину выявляют в виде эмбрионального валика. Особенности гисто- и органогенеза эмбриона собак приведены далее.