В 1951 году супруги Джошуа и Эстер Ледерберги, микробиологи из Висконсинского университета, продемонстрировали изящное и простое доказательство того, что именно имеющиеся изначально мутации, а не постепенно вырабатываемая невосприимчивость, лежат в основе множества случаев приобретения бактериями устойчивости к новым препаратам. Ледерберги обнаружили, что, используя лоскутки бархата, закрепленные на деревяшках размером с чашку Петри, можно одновременно брать сотни крошечных бактериальных колоний из одной заполненной бактериями чашки и переносить их ровно в том же положении на ряд других чашек, содержащих какой-либо антибиотик, например стрептомицин. Если устойчивость вырабатывалась благодаря мутации, изначально имевшейся у немногих бактерий в исходной чашке, то новые колонии должны были во всех чашках со средой, приправленной антибиотиком, возникать ровно на том же месте. Именно это Ледербергам и удалось пронаблюдать: как оказалось, устойчивостью к стрептомицину изначально обладали одна-две клетки на каждый миллион или десяток миллионов. Это означало, что каждый новый антибиотик становится мощным новым фактором бактериальной эволюции, отсеивая всех бактерий, кроме тех, ничем иным не примечательных, кто оказывался способен противостоять его действию. Избавившись тем самым от конкурентов, удачливые мутанты могли расселяться на их месте, тут же порождая новую, устойчивую к антибиотику колонию.
Эта новость стала для медиков источником ложного ощущения безопасности. Если мутации могут дать устойчивость к антибиотикам не более чем одной бактерии на десять миллионов, решение проблемы должно быть простым: нужно всего лишь наносить микробам двойные удары, применяя два разных средства одновременно. Шанс, что у бактерии обнаружится устойчивость к обоим средствам, казался ничтожно малым: один на десять миллионов раз по десять миллионов, то есть на сто триллионов (10). Беда была в том, что бактерий, судя по всему, не убедили эти расчеты. Устойчивость ко многим антибиотикам начала проявляться в больницах и кабинетах врачей уже в конце сороковых и начале пятидесятых. В некоторых случаях такая устойчивость, похоже, вырабатывалась последовательно, то есть в составе штамма, уже устойчивого к одному антибиотику, выделялся подштамм, устойчивый также и к другому. Однако, как ни странно, некоторые врачи сообщали и о том, что они сталкивались с бактериями, которые внезапно превращались из вполне восприимчивых к стандартным средствам в абсолютно устойчивых ко множеству бактерицидных препаратов. Большинство специалистов отвергали эти сообщения как необоснованные.
Хотя в то время никто этого еще не осознавал, предшествующие работы Ледербергов уже указывали на множество причудливых трюков, к которым могут прибегать "простые" бактерии в ходе эволюции для преодоления любых преград, стоящих на их пути. Для начала еще в 1946 году юный Джошуа Ледерберг, которому шел тогда двадцать второй год, поразил научный мир сообщением, что у бактерий бывает половая жизнь. Это утверждение казалось диким, учитывая, что бактерии определенно лишены тех сложных клеточных структур, которые позволяют более крупным и сложнее устроенным организмам сортировать и разделять свои гены по половинчатым наборам, содержащимся в сперматозоидах и яйцеклетках. Было общеизвестно, что бактерии размножаются простым делением надвое, при котором каждой "дочерней" клетке достается точная копия генов "материнской". Этот примитивный способ воспроизводства дает единственной бактерии возможность размножаться быстро и в геометрической прогрессии, порождая несколько миллионов потомков за несколько часов и до миллиарда в течение суток.
Существование полового процесса у бактерий было доказано Ледербергом с помощью набора мутантов кишечной палочки. Каждый из этих мутантов был лишен способности синтезировать одно или несколько жизненно важных веществ. Поэтому такие мутанты могли размножаться только на питательных средах, содержащих тот витамин или аминокислоту, которой они были не способны обеспечить себя сами. Но, смешивая в разных сочетаниях таких частично неполноценных мутантов, Ледерберг получил полноценное "потомство", то есть бактерий, способных самостоятельно производить все нужные им для жизни вещества и успешно расти на питательной среде без каких-либо добавок. Неполноценным мутантам удалось каким-то образом объединить свои генетические активы. У организмов, видимых невооруженным глазом, от червей до человека, родители объединяют свои гены в потомстве путем слияния сперматозоида и яйцеклетки. Что собой представляет "половой акт" у бактерий, этого не знал тогда и сам Джошуа Ледерберг.
Два года спустя Эстер Ледерберг удалось приблизиться к ответу на вопрос, как проходит половая жизнь бактерий. Работая с новым набором мутантов кишечной палочки с измененными пищевыми потребностями, она обнаружила, что они внезапно утрачивали свою "половую функцию". Будучи генетиком, Эстер понимала: исчезновение какого-либо признака часто можно использовать как ключ для поисков гена, который в норме обеспечивает существование этого признака. За несколько лет ей, ее мужу и их итальянскому коллеге Луиджи Кавалли удалось обнаружить некоторый "фактор фертильности". Он находился в колечке из генов, плавающем внутри бактериальной клетки отдельно от ее главной хромосомы. Джошуа Ледерберг назвал такие колечки дополнительных генов плазмидами. Функция находящегося на такой плазмиде гена фертильности, или F-фактора, состоит в том, чтобы вызывать образование пилей – своего рода бактериальных пенисов, вырастающих на наружной мембране клетки, формируя мостики, по которым она может передавать другой бактерии всю плазмиду вместе с содержащимся в ней дополнительным генетическим материалом. Получив этот подарок от клетки-донора, клетка-реципиент сама становится фертильной – то есть способной выстраивать половые мостики и делиться с другими клетками генами, в том числе генами устойчивости к антибиотикам.
Примерно в то же время Эстер получила первые данные, позволившие найти у бактерий еще один способ обмена генами. Она открыла бактериофага лямбда – заражающего бактерий вируса, или "фага", который годами мог оставаться в бездействии в клетках кишечных палочек некоторых штаммов, выращиваемых в ее лаборатории. Время от времени фаг лямбда выскакивал из главной хромосомы зараженной бактерии и нападал на другие бактериальные клетки. Иногда это приводило к их гибели, но в других случаях бактериофаг успешно внедрялся в их хромосому и вместе с ней в бездействии передавался следующим поколениям. Вскоре после этого третий сотрудник лаборатории Ледербергов, двадцатидвухлетний Нортон Зиндер, показал, что бактериофаги, такие как фаг лямбда, замешаны в контрабанде генов. А именно, он показал, что когда бактериофаг вырезается из бактериальной хромосомы, он может случайно забрать кусок этой хромосомы с собой. Чтобы продемонстрировать, что при этом, по его мнению, происходило, Зиндер заражал колонии устойчивой к некоторому антибиотику сальмонеллы, а затем смешивал их в чашке Петри с незараженными и восприимчивыми к этому антибиотику штаммами. В ходе этих операций ему удалось отловить бактериофагов, подхвативших гены устойчивости и передающих эти гены в рабочем состоянии следующей порции заражаемых бактерий. Каждая из таких бактерий, если ей удавалось пережить инфекцию, сразу становилась устойчивой к антибиотику.
Зиндер назвал такую транспортировку генов трансдукцией, чтобы не путать ее с трансформацией – еще одним способом, позволяющим бактериям подхватывать новые признаки. Остававшийся неясным феномен трансформации был открыт еще в 1928 году в ходе эксперимента, проведенного Фредериком Гриффитом, сотрудником британского Министерства здравоохранения. Изучая эпидемию особо тяжелой формы пневмонии, Гриффит начал сравнивать разные штаммы пневмококка и искать отличия между ними. Наряду с другими отличительными признаками у самого смертоносного штамма имелась гладкая капсула, позволявшая пневмококкам выскальзывать из лап иммунной системы зараженного организма. Однажды Гриффит заразил своих подопытных мышей одновременно живым, но безвредным штаммом пневмококка и порцией убитых клеток смертоносного штамма. Очень скоро эти мыши погибли.
Исследуя их кровь под микроскопом, Гриффит обнаружил, что потомки некогда безвредных мутантов были одеты в капсулы. Он еще раз повторил свой эксперимент, чтобы убедиться, что мыши не заразились живыми высокопатогенными бактериями случайно. Нет, дело было не в этом. Прежде безвредные голые пневмококки каким-то образом подхватили способность образовывать капсулы от разрушенных клеток своих мертвых родственников.
В начале сороковых годов Освальд Эвери, Колин Маклауд и Маклин Маккарти из Рокфеллеровского института установили, что исследованные Гриффитом пневмококки подбирали в окружающей среде обрывки молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) патогенного штамма. Тем самым эти ученые получили первые убедительные свидетельства того, что именно из ДНК и состоят гены.
В 1952 году, когда были опубликованы данные об открытиях, сделанных в лаборатории Ледербергов, стало ясно, что бактерии используют целый ряд способов, позволяющих им подхватывать новые признаки. Они могут подбирать гены из окружающей среды, обмениваться ими в ходе конъюгации или получать их вместе с встраивающимися в бактериальную хромосому вирусами. Теперь нам известен и еще один, четвертый путь работающего у бактерий "генетического такси" – так называемые прыгающие гены, или транспозоны, открытые в сороковых годах генетиком Барбарой Мак-Клинток. Транспозон по сути представляет собой какой-либо ген или группу генов с расположенными по краям "вставочными последовательностями" – отрезками ДНК, периодически вырезающимися из одной хромосомы и вставляющимися в другую вместе с расположенными между ними генами.
В клетках растений и животных (содержащих много хромосом в расположенном в центре клетки ядре) транспозоны просто перемешивают гены, при этом время от времени случайно включая их или выключая. У бактерий же транспозон способен переносить гены из главной хромосомы в плазмиду, вместе с которой они могут поставляться другим бактериями. Некоторые транспозоны даже содержат гены независимой транспортировки. Стоит им выскочить из главной хромосомы, как они вызывают образование конъюгационного мостика, по которому транспозон передает в другую клетку копию самого себя.
Бактериальный сверхорганизм
Нет никаких оснований предполагать, что это антибиотики дали бактериям средства, позволяющие им обмениваться генами. В образцах бактерий, взятых у пациентов в начале двадцатых годов прошлого века, были обнаружены плазмиды, бактериофаги и транспозоны – все в наилучшем виде и готовые к переносу. Но те же сохраненные медиками образцы свидетельствуют и о том, что гены устойчивости к антибиотикам были редкостью или вообще не встречались у бактерий, вызывавших инфекционные заболевания в начале XX века.
В пятидесятые годы микробиологи еще не осознавали, насколько активно бактерии обмениваются генами, но последствия такого обмена ярко проявлялись в стенах медицинских учреждений всего мира. В 1959 году в больницах Японии были отмечены вспышки устойчивой ко многим антибиотикам формы дизентерии. Вызывавшие эти вспышки бактерии – шигеллы – не поддавались действию четырех различных классов некогда эффективных антибиотиков: сульфаниламидов, стрептомицинов, левомицетинов и тетрациклинов. Как ни странно, шигеллы, выделенные из стула пациентов до начала лечения антибиотиками, обычно оказывались, судя по результатам анализов, вполне чувствительными к препаратам всех четырех классов. Но применение препарата любого из этих классов каким-то образом делало микробов абсолютно устойчивыми ко всем четырем. Все это выглядело совершенно неправдоподобным, пока одна из исследовательских групп не обратилась к образцам стула, взятым у пациентов до начала лечения. Наряду с представителями нормальной кишечной микрофлоры исследователи обнаружили штаммы кишечной палочки, устойчивые к препаратам всех четырех классов. Не могли ли кишечные палочки каким-то образом передавать свою устойчивость ко многим антибиотикам намного более опасным шигеллам? Как выяснилось, именно это и происходило. Более того, японские исследователи установили, что передавать устойчивость ко многим антибиотикам от кишечных палочек шигеллам и обратно довольно просто: достаточно смешивать устойчивую и чувствительную культуры в одной пробирке.
Англоязычные микробиологи узнали эту новость в 1961 году. В майском номере широко читаемого издания Journal of Bacteriology Цутому Ватанабэ и Тосио Фукасава из Университета Кэйо в Токио не только изложили открытия своих коллег, но и сообщили о фантастических результатах собственных исследований. Им удалось отследить передачу как плазмид, так и бактериофагов, несущих гены устойчивости к антибиотикам, между четырьмя разными видами бактерий: кишечной палочкой (Escherichia coli), шигеллой дизентерии (Shigella dysenteriae) и двумя видами сальмонелл (Salmonella typhimurium и S. enteritidis). Последние два вида относятся к числу самых обычных возбудителей пищевых отравлений. Более того, Ватанабэ и Фукасава установили, что время, требующееся на то, чтобы передать гены устойчивости ко многим антибиотикам в пробирке, составляло в среднем около пятнадцати минут. При этом время прохождения зараженной инородными бактериями пищи по территории кишечной палочки в человеческом кишечнике составляет не один час, то есть его более чем достаточно, чтобы бактерии успели сблизиться друг с другом и поделиться несколькими трюками.
Микробиологам, читавшим эту статью, пришлось усваивать изложенные в ней открытия шаг за шагом. Во-первых, они должны были принять, что бактерии могут накапливать гены устойчивости к антибиотикам как нити бисера, заплетаемые в "фенечку". Во-вторых, оказалось, что любой антибиотик может вызывать распространение устойчивости не только к себе самому, но и к ряду других препаратов, если несколько генов устойчивости очутились на одной плазмиде или внутри одного бактериофага. При этом, в сущности, антибиотик может способствовать распространению любого гена, сколь угодно опасного или благотворного, если он оказался сцеплен с геном устойчивости. Но, быть может, самым глубоким откровением стало то, что японские ученые показали преодолимость барьеров, разделяющих разные виды бактерий. Хотя сальмонеллы, шигеллы и кишечная палочка и относятся к одному семейству, обмен генами между ними означает пересечение границ даже не между видами, а между родами. Это был первый явный признак того, что бесконтрольный обмен генами, по сути, превратил все царство бактерий в один огромный сверхорганизм, объединенный фундаментальным стремлением к выживанию.
Опасность, которой пренебрегли
Хотя новость об обмене генами между бактериями и привлекла внимание микробиологов, практикующие врачи не придали ей особого значения. Призрак непреодолимой устойчивости к антибиотикам казался дальней угрозой, принимая во внимание представлявшийся нескончаемым запас новых антибиотиков, которые делались все эффективнее. Но вскоре канал поступления новых антибиотиков начал пересыхать. В восьмидесятых годах специалисты по фармацевтике осознали, что у них заканчиваются новые биохимические мишени для противомикробных средств. Следующее десятилетие ознаменовалось беспрецедентным ростом высокоустойчивых нозокомиальных (то есть внутрибольничных) инфекций. Помимо обычных источников неприятностей (таких как стафилококки), среди возбудителей этих инфекций были устойчивые к антибиотикам штаммы нормальной микрофлоры, редко вызывавшие проблемы до наступления эры антибиотиков. Важнейшими из этих "хороших микробов, ставших плохими", были энтерококки – семейство шарообразных бактерий, известных как одни из самых невинных, а также самых распространенных микроорганизмов, живущих в кишечнике человека. В былые времена энтерококки не вызывали развития инфекции даже в тех случаях, когда попадали в открытые раны.
Предрасположенность энтерококков к вредоносности, проявившаяся под влиянием антибиотиков, была связана с двумя их неотъемлемыми свойствами. Во-первых, они от природы хорошо переносят жизнь вне организма-хозяина и могут оставаться в живых на открытом воздухе в течение нескольких часов. Кроме того, они способны переносить низкие и даже средние дозы вредных химических веществ, таких как дезинфицирующие средства и антибиотики. К восьмидесятым годам два вида из числа самых устойчивых – Enterococcus faecalis и E. faecium – стали настоящим бедствием отделений реанимации, где через капельницы, мочевые катетеры и трубки для искусственной вентиляции легких они попадали в кровоток и внутренние ткани самых ослабленных пациентов, с нарушенной иммунной системой.
Вначале врачи полагали, что пациенты заражались энтерококками из собственного кишечника. Но вскоре стало ясно, что в больницах плодились свои, особые штаммы энтерококковых "супермикробов". Пропитанная антибиотиками больничная среда способствовала выработке устойчивости, а неидеальные санитарные условия – формированию суперустойчивых штаммов, способных много дней, недель, а возможно и месяцев оставаться в живых на поверхностях спинок кроватей и столешниц и на таких предметах, как стетоскопы, телефоны и пейджеры, которыми пользовались врачи и медсестры, переходя от пациента к пациенту.
Хуже того, энтерококки продемонстрировали умение подхватывать вредоносные гены от других больничных бактерий. Они не только накапливали десятки генов устойчивости к антибиотикам, но и приобрели последовательности ДНК, отвечающие за выработку разрушающих человеческие клетки токсинов (так называемых гемолизинов и адгезинов) – химических когтей, позволивших энтерококкам забраться в такие ранее недоступные для них территории, как мочевые пути и мочевой пузырь. В результате выведенные в больницах энтерококки стали одним из главных хранилищ опасных генов, которые, в свою очередь, передавались другим бактериям, таким как синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) и кишечная палочка. Потомки обычных, безвредных бактерий, вредоносные штаммы этих микробов вошли в число основных возбудителей внутрибольничных инфекций. К середине девяностых годов смертность американцев от таких инфекций оценивалась в восемьдесят восемь тысяч в год, что приблизительно соответствует одной смерти каждые шесть минут – больше, чем от дорожно-транспортных происшествий и убийств вместе взятых.