Клин клином
В начале пятидесятых, когда Хайнц Айхенвальд и Генри Шайнфилд впервые применили считавшийся тогда сомнительным подход, основанный на "конкурентном исключении", они осмелились преднамеренно впрыскивать младенцам клетки золотистого стафилококка, хотя и принадлежащие к сравнительно безвредному штамму этого печально известного микроба. Теперь мы уже точно знаем, что использованный ими штамм 502A позволил спасти жизни многим десяткам, а возможно и сотням новорожденных – пусть даже только потому, что в детских палатах родильных домов тогда свирепствовал высокопатогенный и устойчивый к антибиотикам штамм 80 / 81.
Но и совсем недавно, в начале девяностых, по крайней мере один врач продолжал использовать штамм 502A для борьбы со стойкими и высокопатогенными стафилококками. Расселл Стил переоткрыл этот штамм вскоре после того, как в 1978 году начал работать в Медицинской школе Арканзасского университета в городе Литл-Рок. "Иммунологи в те времена были редкой птицей, – вспоминает он. – Предполагалось, что я должен знать, почему люди вообще заболевают. Поэтому местные дерматологи стали передавать мне самых трудных пациентов, с которыми они сталкивались". Среди этих пациентов были целые семьи, месяцами, а иногда и годами страдавшие от желтых нарывов и кроваво-красных гнойников, вызываемых стафилококковой кожной инфекцией. Поиски данных о таких инфекциях в литературе привели Стила к Шайнфилду, который посоветовал ему заказать ампулу со штаммом 502A в национальном хранилище Американской коллекции культур в Роквилле (штат Мэриленд).
В отличие от "целины" на теле новорожденных, с которыми работал Шайнфилд, кожа пациентов Стила была уже прочно заселена стафилококками. Поэтому он начал лечение с обстрела микробов тяжелой артиллерией, прописав пациентам антибиотики для внутреннего употребления, специальные мази и дважды в день душ с таким мощным антисептиком, как гексахлорофен. После этого он впрыскивал в ноздри каждому из пациентов ощутимую дозу взвеси штамма 502А. Чтобы оценить эффективность метода, Стил сравнивал состояние 20 семей пациентов, которым впрыскивали этот штамм, с состоянием 20 других, которым после тех же обеззараживающих процедур впрыскивали стерильный раствор. Через шесть месяцев из участников исследования осталось 32 семьи (некоторые пациенты переехали, а некоторые принимали в течение этих шести месяцев антибиотики для лечения других инфекций). У 15 из 17 семей, членам которых впрыскивали штамм 502A, он успешно поселился на коже, и ни у кого из этих пациентов уже не развивались ни нарывы, ни сыпь, ни гнойники. При этом из 15 семей контрольной группы у 11 наблюдались рецидивы инфекции.
Дерматологи из города Литл-Рок лишились своего помощника и его необычного метода лечения в 1992 году, когда Стил стал сотрудником Школы медицины Университета штата Луизиана и занялся медицинской практикой в работающей при университете больнице в Новом Орлеане. Несколько лет спустя к нему вновь обратились дерматологи, на этот раз за помощью в борьбе с отвратительными инфекциями, вызываемыми у школьников, особенно членов спортивных команд, устойчивым к метициллину золотистым стафилококком. Когда Стил поделился с ними историями о лечении штаммом 502A, они были готовы попробовать его метод. Но об их планах вскоре проведали больничные юристы. "Не успел я опомниться, как администрация заявила, что это поставит под угрозу репутацию учреждения", – вспоминает Стил.
Надо признать, что возможность преднамеренного заражения человека золотистым стафилококком, даже безвредным штаммом, вызывает беспокойство не только у юристов. "Не думаю, что на этой планете есть такой штамм золотистого стафилококка, лечение которым я мог бы со спокойным сердцем прописать пациенту, – говорит микробиолог из Колумбийского университета Фрэнк Лоуи, один из лучших в мире специалистов по опасным свойствам данного микроба. – Нельзя забывать о том, что в арсенале этого вида имеется слишком много потенциально опасного оружия. Было показано, что даже штамм 502A может вызывать заболевания". Более безопасный подход, утверждает Лоуи, состоял бы в том, чтобы найти потенциального конкурента среди не столь опасных видов стафилококков, таких как повсеместно обитающие на коже Staphylococcus epidermidis и S. warneri.
Примерно в то самое время, когда больничные юристы в Новом Орлеане ставили крест на планах Стила по впрыскиванию золотистого стафилококка в нос пациентам, микробиолог Ричард Халл из хьюстонского Медицинского колледжа Бейлора не мог поверить своим ушам, услышав, какую реакцию вызвала его безумная идея вводить пациентам кишечную палочку в мочевой пузырь. Колледж Бейлора тогда посетила представительница Национальных институтов здравоохранения, искавшая исследовательские проекты, финансирование которых принесло бы пользу американским инвалидам. Халл подумал о пациентах с травмами спинного мозга, лечившихся в расположенном неподалеку Институте реабилитации и исследований, при котором он состоял консультантом. Многие, если не большинство этих пациентов, нижняя часть тела которых была парализована, часто страдали от инфекций мочевого пузыря и почек, иногда даже представлявших угрозу для жизни. Причина инфекций была в постоянных катетерах, которыми пациентам приходилось пользоваться и из-за которых им в мочевые пути попадали бактерии. Проблема осложнялась тем, что неоднократное применение антибиотиков для лечения этих инфекций способствовало постепенной выработке у возбудителей устойчивости ко многим антибиотикам.
Халл придумал способ, как можно было бы остановить такие инфекции. Хотя в норме мочевой пузырь остается стерильным, у некоторых людей, вспомнил Халл, в нем присутствуют бактерии, не вызывающие никаких заболеваний, и присутствие таких безвредных бактерий, судя по всему, не дает другим микроорганизмам туда вселяться. Халл высказал представительнице Институтов здравоохранения следующую идею: надо найти сравнительно безопасный микроорганизм, который можно было бы преднамеренно вводить в мочевой пузырь парализованным пациентам. "Она спросила: ‘А какие могут быть побочные эффекты?’ – вспоминает Халл. – Я ответил: ‘Ну, в некоторых случаях в результате могут развиваться серьезные инфекции, даже с летальным исходом’. Я думал, что на этом разговор и закончится". Но в ответ Халл, не веря своим ушам, услышал: "Хорошо, давайте попробуем". Вот насколько отчаянной была потребность в средстве, которое позволило бы спасти парализованных пациентов от инфекций, высокоустойчивых к антибиотикам.
У Халла уже был на примете конкретный микроб для такого пробиотического средства. С восьмидесятых годов он переписывался с Катариной Сванборг, гинекологом из Швеции. Ей удалось выделить штамм кишечной палочки, который на протяжении многих лет обнаруживался в моче у девочки, не страдавшей совершенно никакими болезнями ни мочевых путей, ни почек. "В США врач ни за что не узнал бы, что там есть бактерии, если бы они не вызвали инфекцию, – объясняет Халл. – Но в Швеции принято в качестве стандартной профилактической меры проводить ежемесячный анализ мочи".
Халл исследовал этого микроба, получившего название E. coli 83972, в лабораторных культурах и прочесал его гены, чтобы убедиться, что он не наделен своеобразными молекулярными крючьями, которые позволяют некоторым штаммам кишечной палочки вызывать серьезные повреждения мочевого пузыря. После этого в ходе двух первых испытаний, проведенных в конце девяностых, урологи из хьюстонского реабилитационного центра ввели штамм 83972 в мочевой пузырь 57 парализованным взрослым пациентам. До лечения пробиотиком все эти пациенты страдали от периодически развивающихся инфекций мочевых путей. За следующий год у всех, кроме двоих, такие инфекции не наблюдались ни разу, а эти двое заразились одной и той же легкоизлечимой болезнью, вызываемой другим микробом, а не пробиотической кишечной палочкой.
В двух хьюстонских медицинских учреждениях продолжается применение в экспериментальном порядке разработанного Халлом пробиотика. Тем временем Халл и его ученики начали тестирование подхода, который может оказаться еще эффективнее: они помещают катетеры в разведенный пробиотик, давая возможность сформироваться на их поверхности защитной биопленке, и только после этого вводят катетеры пациентам. Другой, еще более амбициозный замысел Халла предполагает использование генетически модифицированной разновидности штамма 83972, лишенного любых, даже потенциальных возможностей вызывать неприятности. Создавая эту разновидность кишечной палочки, Халл удалил у нее часть гена, который в принципе мог позволить бактерии прикрепляться к почечной ткани, а также другого гена, который мог позволить ей удерживаться на стенках мочевого пузыря. По словам Халла, выведение из строя этих генов гарантирует, что микроб никогда не задержится там, где его быть не должно, при том что его способность оставаться внутри мочевого пузыря в свободном плавании нисколько не пострадает.
Совершенствуя свое создание в лаборатории, исследователи не могли устоять против искушения сделать и следующий шаг – ввести ему предельно упрощенную, непередаваемую плазмиду устойчивости. Это колечко генов устойчивости может позволить пробиотической бактерии выживать в тех нередких случаях, когда парализованный пациент проходит курс лечения каких-то других инфекций антибиотиками. Халл еще не испытывал свои генетически усовершенствованные штаммы на пациентах: эта идея по-прежнему кажется слишком смелой его начальству. Но он отнюдь не одинок в своем стремлении улучшать микробов с помощью методов генной инженерии.
Супергерой для зубов
Летом 1976 года молодой специалист по микробиологии полости рта Джеффри Хиллман, всего два месяца назад получивший диплом, поступил на работу в бостонский Институт Форсайта. Однажды утром он заглянул в чашки Петри, которые заполнял бактериями зубного налета, и увидел на белом фоне два красных пятнышка. В желеобразную среду, на которой росли бактерии, был добавлен индикатор кислотности, выбеливающийся в присутствии кислоты, в данном случае – молочной, выделяемой Streptococcus mutans, главным виновником кариеса. Красные пятнышки образовались колониями микробов, у которых был поврежден один из генов, управляющих синтезом вышеупомянутого разъедающего зубную эмаль вещества. Мутация нисколько не замедлила их рост. Именно на это и надеялся Хиллман. Впоследствии он показал, что такие бескислотные мутанты прекрасно живут на поверхности искусственных зубов, сделанных из биоминерала гидроксиапатита, ничуть их при этом не повреждая.
"В то время многие ученые по всему миру изучали, какими путями Strepococcus mutans заражает людей, – вспоминает Хиллман, – и нельзя ли заменить у нас во рту один его штамм на другой". Например, исследования показывали, что большинству из нас Strepococcus mutans достается от матери, причем одни штаммы производят намного больше разъедающей эмаль кислоты, чем другие. Более того, стоит некоторому штамму поселиться во рту, и потеснить его, освободив место для другого штамма, оказывается крайне сложно. "Мы проверяли всевозможные безумные идеи, – говорит Хиллман о тактике, применявшейся им и его коллегами, когда они пытались уничтожить этих микробов во рту добровольных участников эксперимента, прежде чем подселять туда полученные экспериментальные штаммы. – В одном случае мы мазали им зубы йодом. В другом – пытались купать их зубы в антибиотиках, залитых в специальные емкости". Но как ни старались Хиллман и его коллеги изгнать собственный штамм S. mutans с зубов человека и как быстро они ни подселяли на его место свою бескислотную разновидность, такая замена никогда не держалась больше пары месяцев. "Медленно, но верно собственный штамм всегда возвращался", – говорит Хиллман.
К 1982 году Хиллману начало казаться, что все возможные ухищрения уже исчерпаны. Тогда-то ему и пришла в голову идея найти бактерию, которую он сможет использовать в качестве киллера. Если получится найти такой суперагрессивный штамм, рассуждал он, то можно будет удалить из него ген, позволяющий ему производить кислоту. Хиллман и два других сотрудника его лаборатории целый год собирали образцы слюны у студентов и сотрудников своего института и получили коллекцию из сотен немного разных подвидов S. mutans. Они проверили каждого из этих микробов на способность изничтожать представителей других штаммов, выращивая их бок о бок в чашках Петри. Когда они увидели, как одна точечная колония расчистила себе безупречный круг на поле, занятом другим штаммом, им стало ясно, что перед ними превосходный кандидат на нужную роль. Анализы показали: этот штамм в большом количестве выделяет неизвестный ранее бактериоцин (природный антибиотик).
В 1985 году Хиллман и двое его коллег сами выступили в роли первых подопытных кроликов, ватными палочками нанеся себе на зубы этот суперштамм. У всех троих он сразу же и навсегда поселился во рту, попутно изгнав оттуда их собственные штаммы S. mutans. Полдюжины исследований, проведенных на крысах, подтвердили предварительный результат: стоило нанести на зубы крысы данный штамм, как он неизменно вытеснял собственный штамм S. mutans данного животного. Но план Хиллмана просто лишить штамм способности производить кислоту натолкнулся на неожиданное препятствие, когда требуемая для этого мутация оказалась летальной. Дело в том, что некоторые штаммы S. mutans, в том числе и обсуждаемый, используют молочную кислоту для выведения из клетки продуктов обмена веществ, которые в противном случае накапливаются, достигая токсичных концентраций.
Хиллману удалось решить проблему, добавив бактерии лишний экземпляр гена производства спирта, что позволило направить выведение продуктов обмена веществ по другому пути. "Штамм, который мы получили в итоге, ничем не отличался от исходного, кроме двух генетических модификаций, известных нам с точностью до буквы", – говорит
Хиллман. Опыты на крысах показали, что с новой разновидностью S. mutans их зубы оставались почти в безупречном состоянии при кормлении пищей с повышенным содержанием сахара, от которой обычно у крыс развивался кариес. С точки зрения безопасности потенциального лекарственного препарата большое значение имело то, что, как показал Хиллман, исходный штамм, поселившийся во рту у него и его коллег, за десять с лишним лет не передался никому из членов их семей.
В 1998 году Хиллман собрал результаты всех этих исследований и обратился в Управление пищевых продуктов и медикаментов за разрешением проверить свой генетически модифицированный штамм S. mutans на добровольных участниках испытаний. "Тогда я, к счастью, еще не знал, что меня ждет", – говорит он. Для начала сотрудники Управления потребовали от Хиллмана как-нибудь покалечить этого микроба, чтобы его было легко уничтожить, если окажется, что он вызывает какие-то неприятности. "Когда я спросил их, какого рода неприятности, они сказали, что понятия не имеют, – вспоминает он. – Должно быть, мы создавали прецедент для оценки безопасности генетически модифицированных организмов".
Хиллман отключил у бактерии еще некоторые гены, на этот раз сделав ее не способной жить без двухразового питания определенной аминокислотой, которая редко встречается в человеческой пище. Чтобы бактерия оставалась живой, испытуемым нужно было ежедневно пользоваться ополаскивателем для рта, содержащим это вещество. "Надеюсь, что когда мы продемонстрируем ее безопасность, нам разрешат использовать бактерию в виде полноценного организма", – говорит Хиллман.
Уверенный, что на этот раз ему удалось соблюсти все необходимые меры предосторожности, в марте 2004 года Хиллман вновь обратился к экспертам из Управления пищевых продуктов и медикаментов, организовав к тому времени биотехнологическую компанию Oragenics для финансирования требуемых клинических испытаний. К своему удивлению, он узнал, что все без разбора штаммы S. mutans, с которыми он работал, отнесли к разряду потенциального биологического оружия. На этот раз экспертная комиссия выдвинула следующие требования: Хиллман мог начать с небольшой проверки на предмет безопасности с участием десяти испытуемых, но все они должны быть совершенно беззубыми, то есть носить полные вставные челюсти, которые, вместе с искусственными зубами, можно окунуть в раствор для дезинфекции, чтобы полностью удалить с них бактерию после недельных испытаний. Пока шел набор участников этого эксперимента, комиссия выдвинула еще несколько требований: у испытуемых дома не должны жить дети, их супруги тоже должны быть совершенно беззубыми и как они, так и их супруги должны быть людьми крепкого здоровья и не старше пятидесяти пяти лет. "Мы проверили больше тысячи потенциальных участников и нашли только двоих, соответствовавших всем этим требованиям", – говорит Хиллман. Мини-эксперимент, проведенный на двух испытуемых в 2006 году, прошел без сучка без задоринки, не выявив никаких побочных эффектов, и после семи дней исследования все бактерии были успешно удалены.
Сейчас, в середине 2007 года, Хиллман по-прежнему ожидает одобрения на проведение своих исследований на людях, имеющих собственные зубы. Но в то время, как Управление пищевых продуктов и медикаментов всячески тормозит работу первого исследователя, создавшего "искусственную микрофлору", которую можно использовать в медицине, в научных журналах появляется все больше публикаций результатов, полученных теми, кто рвется сделать следующий шаг. Смешивая гены разных организмов и подбирая их комбинации, микробиологи в лабораториях по всему миру создают трансгенных микробов, которые могут оказаться способны на куда большее, чем вытеснять своих вредоносных собратьев из человеческого организма. Одна европейская исследовательская группа уже проверила свою трансгенную бактерию на предмет безопасности в эксперименте с десятью пациентами, помещенными на все время эксперимента в больничный изолятор с пониженным давлением, чтобы эта бактерия не могла случайно попасть в окружающую среду.
Трансгенные пробиотики
Сорокатрехлетний голландский фермер уже собирал вещи, чтобы идти домой, когда его остановили медсестры. "За три дня ему стало настолько лучше, что он был готов уйти из больницы, – вспоминает Майкел Пеппеленбос, специалист по молекулярной биологии из Бельгии, работающий в Университетском медицинском центре Гронингена в Нидерландах. – Нам пришлось объяснять ему, что этого ни в коем случае нельзя делать, как бы замечательно он себя ни чувствовал". Тремя днями раньше, весенним утром 2003 года, фермер принял первую горсть небольших капсул, которые ему предписали принимать по десять штук дважды в день и в каждой из которых содержалось около 10 миллиардов клеток используемой в сыроделии бактерии лактококка (Lactococcus lactis). Этот скромный поступок вписал голландца в историю как первого человека, преднамеренно заселенного трансгенными бактериями. В живых микробов, которых он проглотил, был внедрен и работал в их клетках человеческий ген успокаивающего иммунную систему цитокина – интерлейкина-10.