Антигензависимые неспецифические иммуноглобулины
У неиммунизированных людей и животных в сыворотке крови содержится около 2,5 – 7,0 % иммуноглобулинов, значительную часть которых составляют так называемые неспецифические иммуноглобулины (НИГ), т. е. иммуноглобулины с неустановленной антительной специфичностью. Поскольку их синтез также индуцируется данным антигеном, они получили название антигензависимых НИГ. Существует тесный параллелизм между образованием специфических и неспецифических иммуноглобулинов. Установлено, что антитела (специфические иммуноглобулины) и НИГ синтезируются клетками разных субпопуляций B-лимфоцитов. Количество НИГ при первичном иммунном ответе может превышать количество специфических антител в 10–100 раз. Синтез НИГ может быть индуцирован и в покоящихся B-клетках, но только при условии прямого контакта T– и B-клеток за счет антигенспецифического взаимодействия. У B-лимфоцитов есть маркер Ly-1 (СД5). По этому маркеру различают B-1a-лимфоциты (СД5) и B-1b-лимфоциты (СД5). Синтез антигенспецифических антител осуществляют лимфоциты B-2 ("обычные" лимфоциты).
СД5 – типичный мембраносвязанный белок-рецептор. Он есть у большинства тимоцитов, всех зрелых Т-лимфоцитов и других клеток. Лиганды СД5 имеют разные клетки: лимфоидного, миелоидного и эпителиального происхождения, поэтому СД5 B– и T-клетки взаимодействуют не только друг с другом, но и с другими клеточными популяциями. В отличие от B-2-лимфоцитов клетки B-1 используют ограниченный набор Ig-генов, поэтому они обладают специфическим антительным рецептором, главным образом IgM-изотипа, а их переключения на IgG-изотип практически не происходит, вследствие чего клетки B-1 продуцируют только IgM антитела, т. е. НИГ. Считается, что НИГ выполняют функции первой линии защиты от микробных и вирусных патогенов. Однако активация B-1a– и B-1b-клеток под действием микробных антигенов может быть и вредной. Установлено, что СД5 B-клетки играют существенную роль в образовании аутоантител. Количество СД5 B-клеток заметно увеличивается при ряде аутоиммунных заболеваний.
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела – антитела, синтезируемые и секретируемые одним клоном антителообразующих клеток, т. е. клеток, генетически идентичных, происходящих из одного и того же зрелого В-лимфоцита. Поэтому все свойства моноклональных антител: класс иммуноглобулина, структура полипептидных цепей и активных центров, т. е. антительная специфичность, – идентичны. Они распознают только один антиген и взаимодействуют только с ним. В связи с этим значительно повышается и специфичность всех иммунологических реакций, протекающих с участием моноклональных антител. Образование в организме моноклональных антител было обнаружено давно, в частности при плазмоцитомах – при развитии лимфоидных опухолей. В этом случае в организме больного происходит размножение какого-то одного клона лимфоцитов. Синтезируемые ими миелоидные иммуноглобулины представляют собой моноклональные антитела, обладая одной и той же антительной специфичностью. Вместе с тем плазмоцитомные клетки способны, подобно другим раковым клеткам, бесконечно размножаться in vitro.
Искусственное получение клеток-продуцентов моноклональных антител оказалось возможным после того, как в 1975 г. Г. Кёлер и К. Мильштейн разработали методику получения клеточных гибридов – гибридоmм. Они осуществили слияние лимфоцитов селезенки мыши, иммунизированной бараньими эритроцитами, с культивируемыми клетками миеломы и установили, что некоторые из полученных гибридоmм секретируют антитела к бараньим эритроцитам. Для получения гибридmом были использованы такие штаммы миеломных клеток, которые не содержат фермента гипоксантинфосфорибозилтрансферазы и поэтому гибнут в селективной питательной среде – ГАТ (содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин); лимфоциты в такой среде не погибают. Для слияния лимфоцитов с миеломными клетками был использован полиэтиленгликоль, так как под его влиянием сливаются преимущественно размножающиеся или активированные с помощью антигена В-лимфоциты. Возникающие при слиянии клеток гибридомы наследуют от иммунных В-лимфоцитов способность синтезировать иммуноглобулины только одной антительной специфичности и способность размножаться в селективной среде с ГАТ, а от миеломной клетки – способность к бесконечному размножению.
Процесс получения гибридmом довольно сложен и включает в себя следующие основные стадии:
1. Получение линии миеломных клеток. Чаще всего с этой целью применяют мышиные или крысиные клеточные линии.
2. Получение иммунных В-лимфоцитов (антителообразующих клеток) из селезенки иммунизированного соответствующим антигеном животного.
3. Создание таких условий в культурах смешанных клеток, при которых хотя бы некоторые клетки той и другой популяции могли осуществить слияние. Частота слияния относительно невелика: одна гибридома образуется примерно на 10 клеток.
4. Выделение гибридmом и отбор из них интересующего клона.
5. Накопление клеток полученного клона для его практического использования.
Образующиеся на всех стадиях клетки консервируют в жидком азоте, чтобы в любой момент можно было возвратиться на соответствующую стадию и сохранить нужные клоны. Отбор клеток интересующего клона, т. е. продуцирующих антитела заданной специфичности, – наиболее важная стадия гибридомной технологии, так как новообразованные гибридомы нередко являются нестабильными в отношении синтеза антител. Обнаруженные клоны антителообразующих гибридоmм должны быть немедленно реклонированы. Это связано с тем, что после слияния многие гибридные клетки начинают выбрасывать "лишние" хромосомы, пока число их не окажется равным диплоидному набору, поэтому существует опасность утраты той хромосомы, которая несет гены иммуноглобулинов. Путем клонирования полученных гибридоmм возможно разделить моноклональные антитела, специфичные в отношении одних и тех же или различных эпитопов одного антигена, т. е. получить набор моноклональных антител против различных, фактически любых, эпитопов определенной молекулы, или иммуногена. Одно из преимуществ гибридоmм заключается в том, что с их помощью можно получить неограниченное количество антител, которые сохраняют свою высочайшую специфичность и чувствительность. Моноклональные антитела используют для исследования структуры и функций разных частей молекул, а также различных типов клеток, например деталей строения рецепторов Т– и В-лимфоцитов.
Гибридомы можно создавать не только на основе В-лимфоцитов с целью получения моноклональных антител, но и на основе Т-лимфоцитов для получения клонов гибридmом, избирательно синтезирующих те или иные лимфокины. Этим термином обозначают не относящиеся к иммуноглобулинам белки и полипептиды, синтезируемые и секретируемые активированными Т-лимфоцитами. Идентифицированные лимфокины называют интерлейкинами.
Глава 32
Другие формы иммунного ответа. Реакции повышенной чувствительности
Действие антител проявляется немедленно и характеризуется специфичностью. Так, например, если в крови уже имеются антитоксины, то введенный токсин нейтрализуется сразу, как только с ним взаимодействует антитоксин. Соответственно введение иммунной сыворотки или γ-глобулина сразу же создает пассивный иммунитет против возбудителя или его токсина. Нейтрализация антителами возбудителей или их токсинов и обеспечивает состояние иммунитета к ним. Однако не во всех случаях антитела, образование которых индуцирует антиген, обусловливают невосприимчивость к нему. Иногда повторное введение некоторых антигенов, например сыворотки, приводит не к развитию состояния невосприимчивости, а, наоборот, вызывает повышение чувствительности к ней, которое проявляется в виде тяжелых реакций.
С. Рише и Г. Портье в 1902 г. высказали предположение, что такое повышение чувствительности к сыворотке обусловлено наличием в ней чужеродного белка. Своими опытами они показали, что первичное введение собакам экстрактов из актиний не вызывает у них каких-либо токсических проявлений. Однако повторное введение, сделанное через 2 – 9 нед., сразу же вызывало резкое ухудшение состояния собак. У них наблюдались слабость, нарушение дыхания, а некоторые собаки погибали. Смерть наступала даже в том случае, когда повторная доза была во много раз меньше первоначальной. С. Рише назвал эту реакцию анафилаксией (греч. ana – обратно, phylaxis – защита), т. е. состоянием беззащитности против данного яда. Сходные результаты были получены Г. П. Сахаровым в 1905 г. в опытах с повторным введением чужеродного сывороточного белка морским свинкам. Морские свинки, сенсибилизированные первичным введением лошадиной сыворотки, на ее повторное введение также отвечали резко повышенной чувствительностью, крайняя степень проявления которой получила название анафилактического шока. Особенностью этой формы повышенной чувствительности является немедленность ее проявления на повторное введение антигена.
В 1890 г. Р. Кох обнаружил другой тип реакций повышенной чувствительности. Он показал, что при подкожном введении больному туберкулезом туберкулина (антигенный препарат, представляющий собой фильтрат автоклавированной бульонной культуры возбудителя туберкулеза) через 6 – 12 ч на месте введения развивается туберкулиновая реакция: краснота, уплотнение, иногда припухлость. Максимального развития реакция достигает через 24 – 48 ч.
Таким образом, различают два типа повышенной чувствительности: гиперчувствительность немедленного и замедленного типов. Поскольку эти реакции на повторное введение антигена отличаются от обычных реакций иммунитета, они получили название аллергических (греч. allos – другой, ergo – реакция, действие).
Гиперчувствительность немедленного типа
К реакциям гиперчувствительности немедленного типа (ГЧН) относятся: сывороточная анафилаксия, лекарственная анафилаксия, сывороточная болезнь, сенная лихорадка, бронхиальная астма, крапивница и другие аллергические реакции, в том числе к таким аллергенам, как пыльца некоторых растений, красители, шерсть и т. п. В их основе лежат общие механизмы, которые лучше всего изучены при анафилаксии.
Реакции анафилаксии, как и другие реакции гиперчувствительности немедленного типа, являются иммунологически специфичными и проявляются в отношении того антигена, к которому организм сенсибилизирован. Для возникновения состояния сенсибилизации достаточно введения очень малых доз антигена (аллергена). В частности, первичная сенсибилизирующая доза лошадиной сыворотки для морской свинки составляет 0,000001 мл. Состояние повышенной чувствительности развивается через 7 – 14 дней после введения антигена и сохраняется месяцами и годами. Для его выявления вводят внутривенно вторую, разрешающую дозу антигена. Если разрешающую дозу ввести не внутривенно, а внутрикожно, то развивается местная анафилаксия (феномен Артюса). Она характеризуется появлением через 30 – 60 мин на месте введения отека и развитием гиперемии. В последующем воспалительный очаг уплотняется, подвергается некрозу и рубцеванию.
Реакция анафилаксии характеризуется следующими особенностями: иммунологической специфичностью, немедленностью проявления (анафилактический шок развивается через несколько минут после введения разрешающей дозы) и опосредованностью антителами. Доказательством ведущей роли антител в реакциях гиперчувствительности немедленного типа (ГЧН) является возможность переноса состояния повышенной чувствительности от сенсибилизированного донора с помощью его сыворотки или чистой фракции антител несенсибилизированному реципиенту. Такой пассивный перенос анафилаксии с помощью антител приводит к развитию у реципиента состояния повышенной чувствительности, которая может быть выявлена введением ему разрешающей дозы антигена. Другим доказательством роли антител в ГЧН является реакция Праустница – Кюстнера: если сыворотку человека, сенсибилизированного каким-то антигеном, ввести внутрикожно здоровому нормальному реципиенту, а затем ввести аллерген в это же место, то наступит характерная местная реакция ГЧН.
В развитии анафилаксии можно выделить следующие три стадии: 1) иммунологическую, 2) патохимическую и 3) патофизиологическую. Иммунологическая стадия, которая определяет специфичность анафилаксии, характеризуется взаимодействием антигена с антителом, фиксированным на клетках сенсибилизированного организма. Для патохимической стадии характерна активация протеолитических ферментов, в результате действия которых из клеток высвобождаются биологически активные вещества. В настоящее время известно более 30 таких веществ, участвующих в механизме развития анафилаксии, однако основная роль принадлежит гистамину, серотонину, брадикинину и лейкотриенам. Лейкотриены A, B, C, D, E – продукты липоксигеназного превращения арахидоновой кислоты – освобождаются тучными клетками, базофилами и тромбоцитами. Патофизиологическая стадия развивается в результате действия биологически активных веществ на различные системы органов, в особенности на гладкую мускулатуру. Наблюдающееся в результате такого воздействия сокращение гладких мышц определяет клиническую картину анафилактического шока у животных. В частности, у морских свинок поражается гладкая мускулатура бронхов, что ведет к развитию бронхиального спазма. У собак наблюдается спазм гладкой мускулатуры кишечника, у кроликов – спазм легочных артерий, у человека страдает сердечно-сосудистая система. К наиболее характерным симптомам анафилактического шока относятся: гипотония, учащение мочеиспускания и дефекации, отек, лейкопения, тромбоцитопения, снижение титра комплемента, понижение свертываемости крови и температуры тела.
Механизм анафилаксии
Основную роль в механизме анафилаксии и других реакций гиперчувствительности немедленного типа играет процесс взаимодействия с антигеном антител, фиксированных на клетках, которые в результате этого взаимодействия высвобождают биологически активные вещества. Клетками, способными высвобождать медиаторы данного типа повышенной чувствительности (гистамин, брадикинин и т. п.), являются мастоциты и базофилы. Мастоциты находятся в соединительной ткани почти всех органов. Свойством фиксироваться на тучных клетках и базофилах обладают антитела, относящиеся к классу IgE. Ранее, пока природа этих антител не была еще установлена, они получили название реагинов. Особенностью антител IgE является отсутствие у них способности фиксировать комплемент и проникать через плаценту. Полагают, что помимо участия в реакциях ГЧН, антителам IgE принадлежит определенная роль в формировании местного иммунитета.
Цитофильные свойства этих иммуноглобулинов связаны с наличием особых рецепторов, которые располагаются в области Fc-компонента молекулы антитела. Иногда это свойство (цитофильность) называют гомоцитотропностью, т. е. сродством к клеткам собственного вида, или гетероцитотропностью, когда это сродство проявляется по отношению к клеткам другого вида животного. У человека и у некоторых животных антитела, относящиеся к классу IgE, обладают гомоцитотропностью, а гетероцитотропностью – иммуноглобулины IgG-1, IgG-3, IgG-4.
В самом общем виде механизм анафилаксии может быть описан следующим образом. Введение сенсибилизирующей дозы антигена индуцирует образование специфических антител, в том числе относящихся к классу IgE. Благодаря своей цитофильности последние фиксируются на поверхности тучных клеток и базофилов. Этот процесс и лежит в основе сенсибилизации организма к данному антигену. Попадая повторно в организм, он распознается антителами, фиксированными на клетках, и быстро вступает во взаимодействие с ними. Следствием этого является активация протеаз клеток, в результате которой высвобождаются медиаторы, опосредующие патофизиологическую основу анафилактического шока.
Таким образом, одним из необходимых условий развития анафилаксии является наличие доступа антигена к антителам, фиксированным на клетках. Если в крови циркулирует достаточное количество антител, обладающих такой же специфичностью, но относящихся к другим классам иммуноглобулинов (IgG, IgM), они распознают и блокируют его активные центры. Такой нейтрализованный антиген уже не может взаимодействовать с антителами IgE, фиксированными на клетках, поскольку его детерминантные группы блокированы. В случае, если специфичных к данному антигену и свободно циркулирующих в крови антител мало, антиген беспрепятственно достигает клеток, на которых располагаются антитела IgE. Следовательно, для предотвращения реакции ГЧН необходимо индуцировать образование антител, которые бы препятствовали доступу соответствующего антигена к антителам, фиксированным на клетках, т. е. антител классов IgG и IgM.
Развитие анафилактического шока можно предупредить с помощью различных лекарственных препаратов, например атропина, димедрола, эфирного наркоза, а также других веществ с различным механизмом действия (сапонин, желчно-кислотные соли и т. п.). Вместе с тем установлено, что если животное благополучно перенесло анафилактический шок, оно утрачивает на некоторое время (2 – 3 нед.) чувствительность к данному антигену. Такое же состояние десенсибилизации может быть достигнуто путем введения сенсибилизированному животному небольших разрешающих доз специфического антигена. В связи с этим А. М. Безредка предложил для предупреждения сывороточного анафилактического шока перед введением большой дозы сыворотки вводить сначала небольшую ее часть (0,5 – 1,0 мл) подкожно или несколько более мелких, но постепенно возрастающих доз внутривенно с интервалом 15 – 30 мин.
Реакции гиперчувствительности замедленного типа
Этот тип гиперчувствительности возникает при многих инфекционных болезнях, например при туберкулезе, бруцеллезе, дизентерии, токсоплазмозе, некоторых гельминтозах, микозах и т. д., и выявляется с помощью соответствующих кожных реакций, которые служат специфическими диагностическими пробами. Состояние гиперчувствительности замедленного типа могут индуцировать различные лекарственные препараты, красители, антисептики и другие аллергены. К аллергенам органической и неорганической природы, имеющим низкую молекулярную массу, но обладающим способностью соединяться с белками кожи и слизистых оболочек (т. е. являющимся гаптенами), нередко возникает так называемая контактная аллергия. Сенсибилизация формируется в результате длительного контакта с такими веществами и проявляется в местных изменениях на коже и слизистых оболочках. Наиболее типичным примером повышенной чувствительности замедленного типа является аллергическая реакция кожи больных туберкулезом людей и животных на туберкулин. К реакциям гиперчувствительности замедленного типа относится также трансплантационный иммунитет.
Основные особенности гиперчувствительности замедленного типа. Гиперчувствительность замедленная (ГЧЗ), как и повышенная чувствительность немедленного типа, индуцируется веществами антигенной природы и отличается высокой иммунологической специфичностью, т. е. она проявляется только в отношении того антигена, который индуцировал ее развитие. В связи с этим кожные аллергические пробы, выявляющие эти состояния, имеют большое диагностическое значение. Основные отличия гиперчувствительности замедленного типа от повышенной чувствительности немедленного типа следующие.