Основные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клетки. Собственно, именно из-за этих трудностей еще 15–20 лет назад затеи с модификацией генетического аппарата считали безнадежным и даже фантастическим делом.
Необходимо было создать общий и воспроизводимый метод включения кусочков гена в полный генетический аппарат клетки. При этом новый фрагмент гена должен был быть помещен очень точно с соблюдением ряда условий, для того чтобы клетка действительно начала синтезировать новые ферменты. Надо было также обойти сопротивляемость клетки-хозяина: как правило, все изменения генетического аппарата воспринимаются клеткой как "ошибки информации" и исправляются специальными механизмами.
Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью ее обменных механизмов начинает синтезировать "свой" белок. Ученые исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку.
На людях технология генной инженерии была впервые применена для лечения Ашанти Де Сильвы, четырехлетней девочки, страдавшей от тяжелой формы иммунодефицита. Ген, содержащий инструкции для производства белка аденозиндезаминазы (ADA), был у нее поврежден. А без белка ADA белые клетки крови умирают, что делает организм беззащитным перед вирусами и бактериями.
Работающая копия гена ADA была введена в клетки крови Ашанти с помощью модифицированного вируса. Клетки получили возможность самостоятельно производить необходимый белок. Через шесть месяцев количество белых клеток в организме девочки поднялось до нормального уровня.
После этого область генной терапии получила толчок к дальнейшему развитию. С 1990-х годов сотни лабораторий ведут исследования по использованию генной терапии для лечения заболеваний. Сегодня мы знаем, что с помощью генной терапии можно лечить диабет, анемию, некоторые виды рака, болезнь Хантингтона и даже очищать артерии. Сейчас идут более 500 клинических испытаний различных видов генной терапии.
Неблагоприятная экологическая обстановка и целый ряд других подобных причин приводят к тому, что все больше детей рождается с серьезными наследственными дефектами. В настоящее время известно 4000 наследственных заболеваний, для большинства из которых не найдено эффективных способов лечения.
Сегодня существует возможность диагностировать многие генетические заболевания еще на стадии эмбриона или зародыша. Пока можно только прекратить беременность на самой ранней стадии в случае серьезных генетических дефектов, но скоро станет возможным корректировать генетический код, исправляя и оптимизируя генотип будущего ребенка. Это позволит полностью избежать генетических болезней и улучшить физические, психические и умственные характеристики детей.
Сегодня мы можем отметить, что за тридцать лет своего существования генная инженерия не причинила никакого вреда самим исследователям, не принесла ущерба ни природе, ни человеку. Свершения генной инженерии как в познании механизмов функционирования организмов, так и в прикладном плане весьма внушительны, а перспективы поистине фантастичны.
Амбициозный проект
В 1990 году в США был начат проект "Геном человека", целью которого было определить весь генетический год человека. Проект, в котором важную роль сыграли и российские генетики, был завершен в 2003 году В результате проекта 99 % генома было определено с точностью 99,99 % (1 ошибка на 10000 нуклеотидов). Завершение проекта уже принесло практические результаты, например, простые в применении тесты, позволяющие определять генетическую предрасположенность ко многим наследственным заболеваниям.
И вот из последних новостей: английские ученые утверждают, что они нашли способ подправить ДНК, переписав код таким образом, чтобы можно было убрать все генетические ошибки и дефекты. Таким образом, можно предупредить развитие болезней вроде кистозного фиброза, мышечной дистрофии и некоторых видов рака.
Ведь ДНК влияет на работу организма через производство белков, качество которых может страдать от ошибок или мутаций, возникающих в ходе прочтения нитей ДНК. Одна из самых распространенных мутаций заключается в том, что клетка перестает считывать генетические "инструкции" раньше времени и в итоге получается неполный, укороченный протеин.
Данные неполные протеины как раз и стоят за названными выше генетическими расстройствами. Ученые утверждают, что им удалось разработать методику, позволяющую сигнал "стоп" перевести в сигнал "продолжать". Это даст возможность клетке нормально считывать информацию и создавать нормальной длины протеин.
Исследователи смогли добиться успеха как в пробирке, так и с живыми клетками дрожжей. По словам руководителя научной работы профессора И-Дао Ю, суть метода заключается в изменении мРНК (матричной рибонуклеиновой кислоты), которая обычно передает инструкции ДНК клеткам относительно того, как образовывать протеины.
Кто знает, что готовит уже завтрашний день генной инженерии?
Часть IV. Легенда о стволовых клетках
Каких только чудес не приписывают стволовым клеткам! Они и молодость продлевают, и рак лечат, и позволяют получить органы для трансплантации практически из "ничего". Правда, при детальном рассмотрении оказывается, что слухи об их всемогуществе оказываются сильно преувеличенными. Но что из перечисленного правда, а что – раздутая рекламой ложь, можно понять, лишь познакомившись со стволовыми клетками поближе.
Глава 1. Мы были первыми!
Настоящий бум "ревитализации" (омоложения человеческими стволовыми клетками) начался в 1995 году, когда американцы обнародовали сведения о результатах введения этих клеток пожилым людям. У пациентов темнели седые волосы, разглаживались морщины, у мужчин увеличивалась потенция, а у женщин прекращались менопаузы. Для геронтологии (науки о старении) наступили золотые времена.
На эксперименты со стволовыми клетками решились и знаменитости: недавно личный врач Фиделя Кастро заявил, что кубинский диктатор будет жить до 140 лет, и при этом намекнул на использование последних достижений в области клеточной медицины. Ревитализацию опробовали на себе Энтони Хопкинс и Софи Лорен, Элизабет Тейлор и Хосе Каррерас. К клеточной медицине прибегали не только с целью омоложения, но и для лечения серьезных травм и болезней: например, актриса Дэрил Ханна, потерявшая палец на съемках фильма "Убить Билла", собиралась восстанавливать его с помощью имплантата, выращенного из стволовых клеток.
Но что бы ни писали в американских учебниках по биологии, впервые серьезно изучением стволовых клеток занялись все же в Советском Союзе. Еще в 1975 году президиумом Академии наук при Институте цитологии был создан отдел клеточных культур. Параллельно шло формирование легендарной всесоюзной коллекции (сегодня это около 300 тысяч ампул), аналогов которой нет нигде в мире. Естественно, в те времена в основном интересовались лечебным аспектом клеточной медицины и, что называется, экспериментировали с техникой. "Вы не представляете, в какой эйфории пребывали врачи и ученые после того, как стало очевидно, что из стволовых клеток можно воспроизвести любую ткань и орган, – вспоминает генеральный директор клиники "НейроВита" профессор Андрей Брюховецкий. – Мой коллега-американец Майк Мэбэр, например, специально к Олимпиаде в Солт-Лейк-Сити создал из стволовых клеток олимпийские кольца. Другой ученый из Америки вырастил на спине у крысы человеческое ухо… При таких возможностях использовать стволовые клетки в косметических целях никому даже в голову не приходило". Меж тем первые эксперименты с омоложением начались еще в 20-е годы: пионерами были русский врач-эмигрант Воронцов и основатель знаменитой клиники Ла Прери (Clinique La Prairie) Поль Ниеханс – правда, работали они исключительно с клеточным материалом животных. Но даже когда научились выделять стволовые клетки из человеческого зародыша, широкого применения ревитализация в России не получила.
Глава 2. Кто есть кто
Итак, мы точно можем сказать, что стволовые клетки отличаются от всех остальных тем, что могут давать начало любым клеткам организма – и кожным, и нервным, и клеткам крови. Сначала полагали, что во взрослом организме таких клеток нет и существуют они лишь в самом раннем периоде эмбрионального развития. Однако в 1970-е годы А. Я. Фриденштейн с соавторами обнаружили стволовые клетки в костном мозге; в дальнейшем их стали называть стромальными клетками.
Тогда же появились работы, доказывающие наличие стволовых клеток практически во всех органах взрослых животных и человека. В связи с этим принято разделять стволовые клетки на эмбриональные стволовые клетки (выделяют из эмбрионов на стадии бластоцисты – очень ранней стадии развития, когда еще нет ни тканей, ни закладок органов) и региональные стволовые клетки (выделяют из органов взрослых особей или из органов эмбрионов более поздних стадий), которые сохраняют свойства эмбриональных клеток, о чем свидетельствуют обнаруженные в них эмбриональные белковые маркеры.
Стволовые клетки можно выделять и растить отдельно от организма – в культуре ткани. При этом образуются шарообразные клеточные образования. Способность давать множество разнообразных клеточных типов делает стволовые клетки важнейшим восстановительным резервом в организме. Они используются телом как универсальный материал, которым можно заделать все "дыры", возникающие в ходе жизни человека.
Особое удивление биологов вызвало присутствие стволовых клеток в центральной нервной системе. Как известно, сами нервные клетки утрачивают способность к размножению уже на самой ранней стадии своего формирования. Но когда нервная система серьезно повреждена, на помощь нервным приходят стволовые клетки, которые начинают делиться с последующим превращением в нервные и глиальные (одна из разновидностей клеток нервной ткани).
Обнаружить стволовые клетки можно с помощью специальных методов. Дело в том, что в в них производятся специфические белки, которые можно выявить, используя определенную методику. Сначала на каждый белок получают антитела, которые метят светящимся красителем. Такой реагент выявляет белки, присутствующие в стволовых клетках на разных стадиях развития.
Но что заставляет обычные с виду клетки сохранять способность превращаться в любые другие? Очевидно, ответ на этот вопрос также кроется в расшифровке их генной составляющей. И наоборот, изучение хромосом стволовых клеток позволяет ответить на вопрос – где кроется секрет дифференциации тканей?
В ходе сложных анализов и экспериментов выяснилось, что в стволовых клетках гены работают на опережение – производя различные виды рибонуклеиновой кислоты ("программы" для производства белков) задолго до того, как в ней возникнет необходимость.
Удивительное открытие – среди клеток есть "господа" и "рабы"
Многочисленные данные, полученные в ходе изучения стволовых клеток, позволили уточнить организацию соответствующих генных сетей (в условиях целостного организма это иногда не так-то просто). В частности, можно выявить пути взаимодействия так называемых генов-господ и генов-рабов. Господами называют ключевые гены, от которых зависит специфика развития данной ткани или органа, рабами – каскады структурных генов (запускаемые генами-господами), обеспечивающих производство характерных белков и, соответственно, формирование того или иного органа или ткани.
Разделение клеток на "господ" и "рабов" присуще всем животным. Так, у дрозофилы есть ген безглазости, который обусловливает развитие глаза. Если его заставить работать в необычном месте, то глаза могут появиться на брюхе, на лапках, на крыле и в любом другом месте. Сходный ген-диктатор есть и у млекопитающих. Введенный в геном дрозофилы, он дает тот же эффект, что и собственный ген хозяина. Все это свидетельствует о том, "господа" могут распоряжаться клеточными структурами в любом организме!
Так, есть ген, который запускает развитие поджелудочной железы; ген, который отвечает за развитие селезенки, за развитие сердца и так далее. Известны гены-господа и для отдельных зародышевых листков. Так, мутация определенного гена блокирует развитие всей энтодермы в зародыше – при раннем выявлении такой мутации беременность у женщины искусственно прекращают.
Наконец, по сигналу соответствующих генов-господ формируются специализированные ткани и типы клеток. Выявлен ген, который инициирует созревание слоя клеток, выстилающего внутреннюю поверхность сосудов.
Такое глубокое проникновение в иерархическую структуру организации генов было бы невозможно без пристального изучения стволовых клеток. Ведь только из них можно создать живую клеточную колонию вне организма и вдоволь изучать все ее свойства. Ну кто из живых потерпит, чтобы ученые копались в его печени или гландах? А так – вырастил печень в пробирке, и препарируй ее сколько хочешь. Правда, пока о выращивании полноценного органа речь не идет – в лабораториях говорят о создании органоподобных клеточных колоний. Но и это уже довольно много с точки зрения экспериментальной науки.
Глава 3. Зачем нужны стволовые клетки?
Еще до открытия стволовых клеток в тканях человеческого организма были открыты их подобия – так называемые камбиальные клетки. Их основная задача – пополнение клеточного состава, который постоянно тает от функциональных перегрузок или болезней. При столь пристальном внимании к стволовым клеткам немудрено, что камбиальные клетки оказались как-то забыты. А между тем камбиальные клетки – непосредственный участник восстановительных процессов в тканях. Наглядный тому пример – клетки росткового слоя кожи, пополняющие постоянно расходуемый запас зрелых, уже не делящихся клеток кожного покрова. Более того, до открытия стволовых клеток речь шла только о таком способе восстановления.
А вот в нервной ткани камбиальных клеток, способных размножаться, нет. Но там сохраняется резерв молодых клеток – нейробластов, которые восполняют различные дефекты, сохраняя тем самым функциональную способность соответствующего отдела мозга или периферической нервной системы.
Каковы же взаимоотношения стволовых и камбиальных клеток? Возможны ли их взаимопревращения, может ли стволовая клетка дать начало камбиальной и наоборот, происходит ли этот процесс в организме, каково его значение для нормального течения восстановительных процессов и каков (если он существует) его молекулярно-генетический механизм? Решение этих вопросов имеет важное не только фундаментальное, но и практическое значение. Именно в нем кроется секрет – можно ли на самом деле использовать стволовые клетки для обеспечения молодости и здоровья.
Увы, пока результаты противоречивы и вызывают больше споров, чем реального понимания. Так, выяснилось, что даже когда стволовая клетка уже начала преобразование в одну из своих разновидностей, в этот процесс включается сразу несколько программ, и что в результате из нее получится, однозначно сказать нельзя. Достаточно слегка изменить условия и исключить тот или иной фактор, как клетка начнет преобразование в другом направлении.
Правда, когда превращение уже произошло, изменить получившуюся клетку невозможно никакими силами; более того, в отличие от обычных клеток она уже не будет делиться и производить себе подобных.
Что же нового дало открытие стволовых клеток во взрослом организме? Оно изменило наши представления об организации тканей и о механизмах протекающих в них восстановительных процессов. Был сделан новый и очень важный вывод: эмбриональные клетки с высоким потенциалом к развитию сохраняются и во взрослом организме. Более того, они составляют важнейшее звено в цепи восстановительных процессов, о чем ранее не подозревали.
Вот что еще может дать нам понимание происходящих процессов: в ходе клеточного деления из стволовых клеток возникают материнская и дочерняя клетки. Материнские используются для самоподдержания популяции, а дочерние либо "выходят" в камбиальную клетку, либо начинают собственное превращение. Стволовая клетка сохраняет свойства ранних эмбриональных клеток – возможность превращаться в любую клетку, а камбиальная эту способность утрачивает и производит лишь региональные структуры.
Таким образом, в изучении восстановительных процессов сделан большой шаг вперед. Но предстоит еще очень много сделать, чтобы познать тонкие механизмы поведения стволовых клеток и найти возможность использовать эти знания в клинической практике.
Глава 4. Применение стволовых клеток
Уникальные способности стволовых клеток делают их идеальным материалом для трансплантационных методов клеточной и генной терапии. Наряду с региональными стволовыми клетками, которые при повреждении тканей соответствующего органа мигрируют к зоне повреждения, делятся и дифференцируются, образуя в этом месте новую ткань, существует и "центральный склад запчастей" – стромальные клетки костного мозга. Эти клетки универсальны. Они, видимо, поступают с кровотоком в поврежденный орган или ткань и там под влиянием различных сигнальных веществ производят взамен погибших нужные клетки (хотя полученные многочисленные данные такого рода нередко критикуются и требуют дополнительной проверки).
В частности, установлено, что инъекция экспериментальным животным стромальных клеток костного мозга в зону повреждения сердечной мышцы устраняет явления постинфарктной сердечной недостаточности. А стромальные клетки, введенные свиньям с экспериментальным инфарктом, уже через восемь недель полностью перерождаются в клетки сердечной мышцы, восстанавливая ее функцию. Результаты такого лечения инфаркта впечатляющи. По данным Американского кардиологического общества за 2000 г., у крыс с искусственно вызванным инфарктом 90 % стромальных клеток костного мозга, введенных в область сердца, трансформировались в клетки сердечной мышцы.
Японские биологи в лабораторных условиях получили клетки сердечной мышцы из стромальных клеток костного мозга мышей. В культуру стромальных клеток добавляли 5-азацитидин, и они начинали превращаться в клетки сердечной мышцы. Такая клеточная терапия весьма перспективна для восстановления сердечной мышцы после инфаркта, поскольку для нее используются собственные стромальные клетки. Они не отторгаются, и кроме того, при введении взрослых стволовых клеток исключена вероятность их злокачественного перерождения.