Но нашлась все-таки управа и на него! Возбудитель скрепи оказался высокочувствительным к действию сильных окислителей, к мочевине и фенолу. Все как у обычных вирусов, но… если разрушенные ткани, содержащие известные вирусы, смешать в равных количествах со спиртовым раствором йода, то их инфекционная активность исчезнет полностью; в тех же условиях утрачивается 99,9 % (но не 100 %!) инфекционной активности возбудителя скрепи.
Каков же размер этого загадочного возбудителя? К этому вопросу периодически возвращались на протяжении более 60 лет. После долгих споров размеры были определены – от 17 до 27 нм. Первоначально это было установлено с помощью особых фильтров с порами известных размеров, а затем – путем расчетов, на основе определения молекулярной массы, которую, в свою очередь, выяснили по чувствительности возбудителя к ультрафиолетовому свету и проникающей радиации. Но вот эти-то два последних свойства и оказались наиболее удивительными и вызвали немало дискуссий. Судите сами: устойчивость агента скрепи и к ультрафиолетовому свету, и к проникающей радиации оказалась в 100-1000 (!) раз выше, чем у всех известных вирусов.
А где же, спросите вы, данные электронной микроскопии? Каков он собой, этот возбудитель скрепи? Много лет рассматривали исследователи ткани пораженного мозга животных – и не переставали удивляться: в препаратах видны лишь скопления… мембран. Сложенных, скрученных, свернутых в кольцо, наконец, разорванных, но мембран. И – не более!
Тогда в работу включились биохимики. Оказалось, что синтез общего белка в мозговой ткани больных животных и выработка энергии остаются неизменными, общее количество нуклеиновых кислот также сохраняется на прежнем уровне, но зато заметно увеличивается активность ферментов, разлагающих сахара и их производные. Попытки найти инфекционные нуклеиновые кислоты не дали положительных результатов.
Отсутствие ясных представлений о структуре возбудителя и вместе с тем целый набор необычных свойств – все это породило множество разных догадок и послужило основанием для предположений, фантастичность которых порой так же трудно отвергнуть, как и доказать.
Так, например, безуспешные попытки обнаружить инфекционные нуклеиновые кислоты в зараженныхтканях побудили некоторых исследователей высказать мнение, что агент скрепи представляет собой самореплицирующуюся белковую молекулу. Но тогда трудно понять повышенную устойчивость возбудителя к нагреванию и формалину и тем более – ктрипсину и пепсину.
Высокая устойчивость к ультрафиолетовому свету, повышенная чувствительность к энергичным окислителям и наблюдаемая повышенная активность ферментов, разлагающих сахара! Не значит ли это, что возбудитель скрепи представляет собой вовсе не белок, а сложную молекулу полисахарида?
Но ни белковая, ни полисахаридная гипотезы не получили распространения в связи с тем, что выделенные из зараженных тканей фракции белков или полисахаридов не обладали инфекционностью. Значительно более привлекательной явилась в свое время так называемая мембранная гипотеза. Англичане Р. Гиббонс и Г. Хантер тоже исходили из того, что при скрепи не удается обнаружить главной вирусной структуры – нуклеиновой кислоты. Поэтому ученые предложили рассматривать возбудителя как составную часть клеточной мембраны. На чем они основывались? Во-первых, высокая чувствительность агента к тем веществам, которые как раз и разрушают клеточные мембраны. Затем, значительная инфекционность препаратов отдельно выделенных мембран. И наконец, данные электронной микроскопии, по которым, как мы помним, в местах поражений мозговой ткани всегда присутствуют мембранные структуры.
Хотя мембранная гипотеза и объясняла многие особенности возбудителя скрепи, но вместе с тем она не могла ответить на главный вопрос: что же представляет собой собственно инфекционное начало, пусть даже связанное с мембранами?
И здесь, как акт отчаянья, возвращение исследователей к вирусной гипотезе возбудителя скрепи. Ведь первые же исследования агента скрепи заставили думать о нем как о вирусе, и не случайно на протяжении многих лет скрепи изучался главным образом именно вирусологами. Как мы увидим далее, именно вирусологам удалось в последующие годы разгадать ряд принципиально важных частей этой дьявольской шарады.
Действительно, с точки зрения экспериментальной вирусологии не существует, казалось бы, причин, по которым возбудителя этой медленной инфекции нельзя было бы отнести к вирусам. И перечень свойств уже достаточно внушителен:
– возбудитель инфекционен;
– его размеры соответствуют размерам ряда известных вирусов человека и животных (например, вирусов полиомиелита, ящура);
– возбудитель не размножается на искусственных питательных средах;
– он хорошо размножается в организме животных;
– способен к длительной персистенции в различных тканях организма и в культуре клеток, приготовленных из таких тканей;
– чувствителен к действию мочевины и фенола;
– в зараженном организме возбудитель, достигнув определенного уровня размножения в лимфоидной ткани (в селезенке и в лимфатических узлах), прорывается в центральную нервную систему, где и вызывает характерные патологические изменения.
Иными словами, агент скрепи ведет себя как классический нейротропный (поражающий нервную систему) вирус, но только очень медленно реализующий свое болезнетворное действие.
А как же быть с большей частью необычных физико-химических свойств возбудителя? Много лет ускользающая разгадка заставляла ученых искать все новые методы исследования и самого возбудителя, и вызываемого им патологического процесса. Именно поэтому специалисты подвергли детальному анализу животных, зараженных возбудителем скрепи. И оказалось, что после заражения не у всех из них развивается заболевание. Так, козы обладают 100-процентной чувствительностью (из 100 зараженных заболевают 100) к агенту скрепи, в то время как у овец она значительно варьирует. Например, овцы породы хердвик отличаются наивысшей (78 %) чувствительностью, у дерби чувствительность уже 35 %, у шотландских черномордых - 18, у суффолков - 12, у шропширских овец - 5, а у дорсетов - 0 %!!!
Неодинаковая чувствительность к скрепи у различных пород овец привела к мысли, что естественное распространение заболевания может зависеть и от генетических особенностей хозяина. И действительно, удалось вывести особую линию мышей, у которых после внутримозгового заражения скрепи развилась не как обычно – через 25 недель, а лишь спустя 40 недель.
В дальнейшем выяснилось, что длительность инкубационного периода у мышей зависит от состояния особого гена, который контролирует время начала размножения агента скрепи в организме зараженных животных.
Но длительность инкубационного периода связана с особенностями не только организма, но и самого агента, которого, как оказалось, имеется несколько разновидностей (штаммов). Поэтому в конечном счете продолжительность инкубационного периода будет зависеть и от штамма инфекционного агента, и от генетических особенностей хозяина. В ходе распутывания всех этих хитросплетений удалось выделить два штамма агента скрепи, один из которых вызывал заболевание, характеризующееся постоянным стремлением чесаться, а другой приводил к развитию у животных состояния сонливости.
К наиболее интересным загадкам скрепи, как, впрочем, и других представителей группы трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (группа объединяет такие заболевания, как уже известное читателю куру, а также болезнь Крейтцфельдта – Якоба, речь о которой будет дальше), относится всякое отсутствие каких-либо признаков иммунологической реакции организма.
Как известно, после проникновения любого вируса (или другого инфекционного агента) в организме развертывается сложная цепь защитных реакций, одной из которых и является выработка специфических антител к данному вирусу. И у нас в стране, и за рубежом ученые, используя все известные иммунологические реакции, пытались обнаружить хотя бы мизерные количества антител к агенту скрепи, но ни разу не добились успеха. Пробовали также вводить мышам сверхбольшие дозы мозга зараженных скрепи мышей – и опять безуспешно.
В организме зараженных скрепи животных ни в инкубационном периоде, ни во время клинически выраженного заболевания не было обнаружено даже признаков образования интерферона. Пробовали подойти к решению проблемы с другого конца: зараженным скрепи мышам стали вводить вещество, обычно резко стимулирующее в организме синтез интерферона. Но еженедельное введение мышам стимулятора на протяжении 7 месяцев не оказало никакого влияния на развитие у них инфекционного процесса. В то же время если зараженным скрепи мышам вводить любые другие вирусы или белки, то в ответ на это в их организме начинают активно вырабатываться специфические антитела на эти вирусы или белки.
Поиск возбудителя продолжался.
А между тем скрепи до сих пор встречается в различных странах Европы, Азии, Северной и Центральной Африки, Южной Америки и в 29 штатах США. В то же время заболевание искоренено в Австралии, Новой Зеландии и Южной Африке.
Источником заражения являются больные животные – овцы или козы. Более 100 лет назад была подмечена передача скрепи от больных животных здоровым на одних пастбищах. Примечательно, что для возникновения скрепи вовсе не обязательно присутствие больных животных – достаточно поместить здоровых овец на фермы, на которых ранее регистрировались случаи скрепи.
Объединенными усилиями французских и американских исследователей были получены строгие доказательства того, что возбудитель скрепи вызывает ранние изменения белкового синтеза в некоторых мембранах. Итак, кое-какие изменения при попадании в организм агента скрепи все-таки обнаружены. Значит, нет оснований опускать руки. Тем более что каждый год приносит все новые результаты.
Исследования природы агента скрепи велись всеми доступными средствами. И нужно ли удивляться тому, что вопрос о природе агента скрепи в свое время перешагнул рамки научных журналов, попав на страницы периодических изданий во всем мире. Вот лишь некоторые из заголовков статей на эту тему: "Странный организм: ни вирус, ни бактерия" (За рубежом. 1982. № 20); "Организм… без генетического материала" (За рубежом. 1983. № 52).
И неизвестно, сколько времени задавались бы эти вопросы (без ответов!), если бы в выяснение природы возбудителя скрепи не включился молодой американский профессор неврологии из Калифорнийского университета в Сан-Франциско Стенли Прузинер (см. фото).
С. Прузинер в 1982 году высказал предположение, что агент скрепи может представлять собой либо очень небольшой олигонуклеотид (нуклеотид – составная часть нуклеиновых кислот, а олигонуклеотид – соединение из нескольких нуклеотидов) с тонкой белковой оболочкой, либо инфекционный белок, полностью лишенный нуклеиновой кислоты.
Строго говоря, предположение о скрепи как о самореплицирующейся белковой молекуле, как мы помним, было высказано еще за 20 лет до этого, однако оно не послужило основой для последующих экспериментов.
С. Прузинер, приступая к исследованиям, решил прежде всего провести сравнительный анализ действия на инфекционный агент скрепи веществ, разрушающих белки, и веществ, разрушающих нуклеиновые кислоты. Результаты опытов оказались достаточно однозначными: воздействие веществ первой группы всегда лишало агент скрепи его болезнетворности, в то время как вещества второй группы не снижали способности агента вызывать заболевание.
Вслед за этим исследователь усовершенствовал способы накопления возбудителя, с тем чтобы получить его более высокие концентрации. Им были использованы зараженные хомяки, у которых в мозговой ткани накапливалось в 100 раз больше возбудителя, чем в мозговой ткани мышей. Получив мозговую ткань с высоким содержанием возбудителя скрепи, С. Прузинер постепенно начал ее очищать от примесей, одновременно строго следя за сохранением инфекционных свойств.
Особенно эффективной оказалась комплексная очистка, включающая экстракцию детергентами, дифференциальное центрифугирование, обработку нуклеазами, протеазами и анализ в гелиевом электрофорезе.
В результате такого подхода удалось очистить исходный материал в 100 раз! Дальнейшее усовершенствование очистки инфекционного материала (включавшее фракционирование в градиенте плотности сахарозы) позволило выявить, что белок уже представлен молекулами одного вида.
Это был нелегкий путь. Стенли Прузинер долго искал – и нашел! Нашел, что инфекционность агента связана с низкомолекулярным белком, не содержащим никакой нуклеиновой кислоты.
Это было открытие совершенно нового класса инфекционных агентов, принципиально отличающихся от простейших, бактерий, вирусов и даже вироидов!!!
Судите сами: все известные доныне инфекционные агенты, к какому бы классу они ни относились, обязательно содержат одну из двух (а иногда и обе одновременно) нуклеиновых кислот. И даже простейшие из них – вироиды, которые (в противоположность вирусным частицам) вовсе лишены белковой оболочки, и те представлены обладающей инфекционностью изолированной молекулой рибонуклеиновой кислоты.
Так что же представляет собой подобный инфекционный белок? Инфекционный белок, открытый С. Прузинером, лишен нуклеиновых кислот, но одновременно, как выяснилось, обладает свойствами, отсутствующими у других возбудителей инфекционных заболеваний: устойчивостью к УФ-свету и проникающей радиации, к повышенной температуре, к действию пепсина, трипсина, протеазы К и ацетилэтиленамина, псораленов и формалина; он слабочувствителен к действию n-пентанола, n-бутанола и ультразвука.
Это открытие было столь грандиозным, что его даже не смогли сразу оценить по достоинству. И лишь спустя 15 лет, в 1997 году, "за открытие прионов" С. Прузинер получил Нобелевскую премию.
Обнаруженный белок С. Прузинер назвал инфекционный прионный белок, а термин прион – всего лишь анаграмма английских слов PROteinaceous INfectious (particles) – белковая инфекционная (частица).
Термин прион, по мнению С. Прузинера, как нельзя лучше подходит для обозначения инфекционной единицы – наподобие того, как употребляется термин вирион для обозначения одной вирусной частицы любого происхождения. Такой выбор всем понравился, и все трансмиссивные губкообразные энцефалопатии человека и животных после этого получили современное название прионные болезни человека и животных. И термин прион, или инфекционный прионный белок, обозначаемый символом PrP (Prion Protein Scrapie), как и некоторые другие термины, с которыми мы сейчас познакомимся, уверенно разместился на страницах научной литературы.
О каких еще терминах идет речь?
Оказалось, что прионный белок, т. е. белок того же аминокислотного состава и той же самой молекулярной массы, что и инфекционный прионный белок, содержится в организме всех млекопитающих, включая, естественно, и человека. А его наивысшая концентрация обнаруживается в нервных клетках (нейронах). Как удалось выяснить, этот нормальный клеточный прионный белок (потому что вырабатывается в клетках), обозначенный символом PrP (Prion Potein Cell), выполняет разнообразные весьма важные для организма функции.
Он участвует в передаче нервных импульсов между окончаниями нервных волокон, в сохранении устойчивости нейронов и клеток глии (клетки глии выполняют защитную функцию по отношению к нейронам) к окислительному стрессу, вовлекается в процессы регуляции содержания внутриклеточного кальция (Са) в нейронах, но самое главное – поддерживает так называемые циркадианные ритмы (от латинских слов circa – "около" и dies – "день"), т. е. околосуточные ритмы активности и покоя в клетках, тканях, органах и в организме в целом.
Тем из вас, кто совершал дальние перелеты, например, из Москвы на Дальний Восток или, скажем, в Вашингтон (и, конечно, обратно), хорошо знакома ситуация, когда, перелетев через несколько часовых поясов (если разница во времени велика), никак не войдешь в ритм жизни того места, куда прилетел. Обратите внимание, что в своей регулирующей функции клеточный прионный белок играет роль своеобразного успокоителя, с определенной (околосуточной) периодичностью тормозя активность клеток, тканей и организма в целом.
Как оказалось, в этом нетрудно убедиться: если искусственным образом (а такие способы есть) снизить или вовсе лишить, например, мышку способности вырабатывать в организме клеточный (нормальный) прионный белок, то в этом случае спустя некоторое время у мышки резко сократится период сна, а затем животное и вовсе погибнет от развившейся бессонницы.
В 1986 году итальянский ученый Е. Лугарези с коллегами обнаружили и описали новую медленную инфекцию у людей: у них в организме вдруг начинал резко снижаться синтез клеточного прионного белка. Болезнь, всегда заканчивающаяся смертью, получила название смертельная семейная бессонница. Наверное, комментарии здесь излишни… Вот, оказывается, что такое клеточный прионный белок!
Теперь пришло время задать главный вопрос – чем же различаются нормальный и инфекционный прионные белки, если они одинаковы по молекулярной массе и аминокислотному составу?
Различия есть! Главное – в их третичной структуре, т. е. в пространственном расположении цепей молекул аминокислот. "И только?" – может возникнуть вопрос. Да, этого, оказывается, достаточно для того, чтобы жизненно необходимый клеточный прионный белок ("друг") превратился в смертельно опасного "врага" – инфекционный прионный белок. Вот уж действительно: если "от великого до смешного – один шаг", то здесь, как мы видим, от жизненно необходимого до смертельно опасного – полшага!
Следовательно, собственно прионный белок может существовать в двух формах – нормальной и инфекционной, и такое превращение нормального прионного белка в его инфекционную форму является фундаментальным событием, лежащим в основе размножения инфекционных прионов.
Оказалось, что процесс размножения и накопления инфекционных прионов в зараженном организме принципиально отличается от процесса размножения всех известных инфекционных агентов, в том числе и самых мельчайших, например бактерий, которые увеличиваются в числе в результате простого деления, а также от процесса размножения вирусов, для которого существует специальный термин – репродукция.