Вскоре после обнаружения скрытой вирусной инфекции у бактерий начали появляться сообщения о существовании скрытых вирусных инфекций у растений. Так, в 1930 году два сотрудника Кембриджского университета, В. Сэлмен и С. Л. Пелей, сделали интересное открытие, работая с различными сортами картофеля. Исследователи привили черенок внешне вполне здорового картофеля сорта "Король Эдуард" на растение другого сорта и вскоре обнаружили у последнего признаки развития тяжелого вирусного заболевания. Позднее оказалось, что каждое растение сорта "Король Эдуард", полученное из любой части Англии, при прививке другим сортам картофеля вызывает у них развитие тяжелого вирусного заболевания. Так был открыт Е-вирус картофеля, которым действительно были заражены все растения сорта "Король Эдуард", поддерживавшие скрытую вирусную инфекцию и внешне выглядевшие совершенно здоровыми.
Прошло немного времени, и скрытые вирусные инфекции обнаружили у сахарной свеклы, томатов, огурцов, картофеля других сортов, у хмеля, малины, гороха, у разнообразных цветов и даже у гигантских деревьев тропических лесов. Исследователи открыли целый ряд передающихся через почву вирусов, которые, как выяснилось, размножаются в обычных сорняках, но выявляются только тогда, когда поражают культурные растения, имеющие важное хозяйственное значение.
В 1937 году французские ученые Эритье и Тейсье открыли у некоторых плодовых мушек дрозофил неожиданное свойство – очень высокую чувствительность к действию диоксида углерода (СO2), выражающуюся в быстро наступающей гибели насекомых, помещенных в атмосферу этого газа. Обычно плодовые мушки хорошо переносят подобное воздействие, и СO2 может вызывать у них лишь временный наркоз. Прошло несколько лет, и оказалось, что всему виной так называемый вирус сигма, заражение которым у мушек внешне ничем не проявляется, обнаруживаясь лишь наличием повышенной чувствительности насекомых к диоксиду углерода. Скрытая инфекция вирусом полиэдроза была обнаружена у гусениц тутового шелкопряда. Этот вирус у них передается по наследству. Японский исследователь К. Ямафуджи установил, что если гусениц тутового шелкопряда кормить на листьях, смоченных азотистокислым калием, ацетоксином или гидроксиламином, то скрытая вирусная инфекция переходит в явную.
Шли годы. Чем глубже ученые проникали в тайны вирусов, тем чаще они наблюдали случаи, когда вирусное заражение не приводило к развитию заболевания. Еще в 1921 году в Пастеровском институте в Париже известный французский вирусолог С. Левадити выделил из слюны внешне здорового человека инфекционный вирус герпеса.
В своих исследованиях ученые неоднократно сталкивались со случаями выделения инфекционных вирусных частиц внешне уже здоровым организмом, перенесшим заболевание. Вирусоносители (и люди, и животные) длительное время выделяли вирусы после выздоровления от полиомиелита, вакцинальной инфекции, ящура, чумы птиц и др.
Эти примеры ясно указывали на то, что выздоровление вовсе не всегда означает освобождение от вируса, в подобных случаях острая инфекция (болезнь) может переходить в скрытую форму инфекционного процесса.
Такого рода факты постепенно накапливались. Они не сразу привлекли к себе всеобщее внимание и уж совсем не сразу заставили ученых задуматься над их сутью. Поначалу подобные явления многим казались казуистикой, эдакими фокусами природы (мол, чего в жизни не бывает!) и каждый раз вызывали удивление, а порой и изумление. А все, наверное, потому, что еще не было сделано важного открытия, которое в силу своей неожиданности и, главное, простоты смогло бы перевернуть прочно укоренившееся представление о неизбежности смертельной схватки при встрече вируса с организмом другой природы.
Но вот такое открытие наконец было сделано.
Лед сломан
Зимой 1952 года группа американских вирусологов – В. Роу, Р. Хюбнер, Л. Гилмор, Р. Паротт и Т. Уорд – для приготовления тканевых культур получили из детской больницы в Вашингтоне удаленные хирургическим путем аденоиды и миндалины внешне здоровых детей. Биологическую ткань измельчили ножницами и каждый отдельный кусочек поместили в пробирку с питательной средой. Пробирки поставили в термостат, внутри которого поддерживалась температура 37 °С, что соответствует температуре человеческого тела. За состоянием тканевых кусочков ежедневно наблюдали в микроскоп.
В пробирках началось размножение клеток, с каждым днем их становилось все больше и больше. Культуры ткани (так это называется) росли, им периодически меняли питательную среду.
Прошло уже много дней, как вдруг в некоторых культурах появились признаки цитопатического действия, т. е. началось их разрушение, дегенерация: клетки потемнели, потом отслоились друг от друга, затем стали сморщиваться и распадаться. Процесс нельзя было остановить, и вскоре многие культуры ткани (полученные от внешне здоровых детей!) погибли.
Желая выяснить причину этого, ученые в первую очередь решили проверить на предмет наличия бактерий питательную среду, на которой росли клетки, для чего добавили ее в питательный бульон, в котором, как известно, прекрасно размножаются различные бактерии. Ведь не исключено, что именно из питательной среды бактерии могли попасть в культуры ткани и вызвать гибель клеток. Но нет, бульон на протяжении многих дней оставался стерильным, следовательно, бактерий в культурах не было. Тогда питательную среду пропустили через бактериальные фильтры - специальные фарфоровые или целлюлозные пластинки с порами, по размерам меньшими, чем величина даже самых маленьких бактерий. С помощью таких фильтров можно легко отделить бактерии от вирусов в любом растворе: бактерии задержатся фильтром, а вирусы, пройдя сквозь поры фильтра, оказываются в фильтрате – жидкости, прошедшей через фильтр.
Пропустив через бактериальный фильтр питательную среду с разрушенными тканями, исследователи полученный фильтрат внесли в свежую культуру ткани, клетки которой хорошо размножались. Спустя несколько дней в этой культуре обнаружились признаки клеточной дегенерации. Далее еще раз питательную среду пропустили через бактериальный фильтр и полученный фильтрат добавили к свежей культуре. Подобные пересевы проделали 17 раз подряд, и каждый раз фильтрат погибшей культуры вызывал гибель клеток вновь зараженной ткани.
Напрашивался простой вывод: в аденоидной ткани и в ткани миндалин внешне здоровых детей находился некий быстроразмножающийся мельчайший инфекционный агент, способный проходить через бактериальные фильтры, задерживающие бактерии (значит, не бактерия!), и этот агент постоянно размножается в тканевой культуре. Так были открыты хорошо теперь известные аденовирусы.
Естественно, после этого открытия ученых заинтересовал главный вопрос: почему аденовирусы, присутствовавшие в организме детей, не вызывали развития признаков заболевания? Помните, ведь дети, от которых первоначально были получены ткани аденоидов и миндалин, были практически здоровыми.
Необходимы были новые исследования. Прежде всего следовало выяснить, почему гибель кусочков тканей наступает не сразу, а лишь спустя 10, 20 и более дней после начала их культивирования в пробирках. Для обнаружения инфекционного агента только что выделенные ткани миндалин тщательно измельчают ножницами, разрушают растиранием с песком или попеременным замораживанием и оттаиванием. Увы! Ни в одном случае из подобных клеточных гомогенатов (однородная масса из измельченных тканей различных организмов) вирус выделить не удается. Но зато в таких тканевых суспензиях обнаруживаются антитела к аденовирусам!
Антитела – вот причина неудач прежних опытов! Ученые высказывают мнение, что именно антитела маскируют вирус. В процессе культивирования кусочков тканей при смене питательной среды антитела вымываются, вирус освобождается от их воздействия и становится доступным для обнаружения (по его разрушающему действию на клетки).
В работу включаются все новые исследователи. Теперь опыты ведут не на культурах ткани (кусочках), а на культурах клеток. Давайте познакомимся с методом клеточных культур, и вы сами убедитесь в его преимуществе перед методом культур тканей.
Кусочки разнообразных тканей, как и в предыдущем методе, предварительно измельчают ножницами или острой бритвой, помещают в стеклянную колбу, заливают теплым раствором трипсина и начинают помешивать.
Трипсин уже много лет широко применяют для приготовления из кусочков различных тканей клеточных взвесей. Этот фермент обладает замечательным свойством переваривать межклеточное вещество, благодаря чему маленькие кусочки ткани быстро распадаются на отдельные клетки. Полученную взвесь клеток осаждают в центрифуге на дно пробирки, после чего трипсин сливают, а осадок клеток вновь разливают по пробиркам или так называемым матрасам – стеклянным флаконам с плоскопараллельными стенками, напоминающим по форме кирпичики. В таком виде клетки разводят, но на этот раз специальной питательной средой. Осев на стенки пробирки или матраса и прикрепившись к стеклу, клетки начинают делиться.
Постепенно клеток становится так много, что они образуют пласт на поверхности стекла, или, как принято говорить, однослойную культуру клеток – сплошной "ковер" толщиной в одну клетку. Легко представить, что если такой слой снять с поверхности стекла (при этом клетки отслоятся от стекла и друг от друга), развести свежей питательной средой в несколько раз и засеять ими вновь соответственно 2, 3 или 4 новых матраса, то спустя 3–5 дней после этого можно будет вновь получить новый урожай клеток.
Так размножают клетки во всех лабораториях мира, чтобы потом, например, заражать их вирусами и наблюдать характер и особенности действия вирусов на слой в целом и на отдельные клетки. Под действием вирусов в определенных клеточных культурах развиваются процессы гибели клеток (цитопатическое действие вируса), клеточный слой при этом часто расчленяется на отдельные клетки или на группы клеток, которые темнеют, сморщиваются, а затем постепенно разрушаются. Интересно, что многие вирусы в определенных клеточных культурах обладают способностью вызывать только присущую им характерную картину постепенной гибели (цитопатического действия) клеточной культуры.
Метод клеточных культур внес неоценимый вклад в изучение процесса взаимодействия вирусов с клетками. В отличие от культивирования тканей, при заражении клеточного слоя можно точно дозировать количество вируса на одну клетку; кроме того, практически весь слой клеток доступен микроскопическому исследованию и подсчету. Метод клеточных культур, таким образом, позволил проводить строго контролируемые количественные исследования с вирусами, которые оказались особенно необходимыми для поиска противовирусных лекарственных средств, для изучения макромолекулярных синтезов в зараженной клетке, при расшифровке тонких механизмов вирусной репродукции.
Итак, получив культуру клеток человека, американский вирусолог Р. Гинсберг заразил их аденовирусом и добавил в питательную среду противоаденовирусные антитела. И что же?
Клетки прекрасно размножались в присутствии этих антител, и вскоре их накопилось так много, что можно было пересевать в новые матрасы. При этом в питательную среду снова добавили антитела. Далее клетки в присутствии противоаденовирусных антител успешно пересевали 26 раз, но однажды при очередном пересеве в питательную среду уже не добавили антитела…
Через несколько дней в клеточной культуре появились признаки дегенерации клеток, и вскоре культура погибла, а в питательной среде были обнаружены большие количества аденовируса. Вот вам и ответ на главный вопрос! В зараженных клетках много дней и ночей размножался аденовирус, но в присутствии антител он не мог проявлять своего губительного действия на культуру. После того как из питательной среды убрали антитела, вирус начал усиленно размножаться, быстро разрушая клетки.
Следовательно, и в организме человека размножение аденовируса никак себя не проявляет благодаря присутствию противоаденовирусных антител, которые, не уничтожая вирус полностью, сдерживают его размножение в рамках "мирного сосуществования" с хозяином (организмом).
Такое объяснение было простым и понятным, оно логически вытекало из описанных выше наглядных опытов с клеточными культурами, и, кроме того, этот вывод подкреплялся широко известными фактами частого обнаружения в сыворотке крови многих внешне здоровых людей значительных количеств противоаденовирусных антител.
Открытие аденовирусов оказалось тем важным событием, которое в силу своей простоты, а потому и наглядности убедительно доказывало возможность существования в организме человека скрытой вирусной инфекции, а также проливало свет (вспомните опыт с клеточными культурами!) на причины поддержания вирусоносительства, т. е. на "маскирующую" роль антител. Именно это открытие аденовирусов и послужило мощным стимулом активного поиска и изучения скрытых вирусных инфекций в природе. И прежде всего – в организме человека и животных. К чему же привели эти поиски?
Что такое "персистенция вирусов"
Итак, исследования разворачиваются все более широким фронтом.
Теперь ученые ищут ответы на следующие вопросы: если вирус может размножаться в организме человека без признаков заболевания, то как уследить за его рассеиванием в окружающей среде и к каким последствиям все это может привести?
В активный поиск включаются многие лаборатории во всем мире. И достаточно быстро скрытые вирусные инфекции начинают находить там, где их ищут. Так, аденовирусы удалось обнаружить не только в аденоидах и миндалинах, но и в легких, и во внутрибрюшинных лимфатических узлах здоровых людей. Кроме аденовирусов из организма внешне здоровых людей были выделены вирусы кори, краснухи, герпеса, классической чумы птиц, цитомегалии, ветряной оспы, клещевого энцефалита, полиомиелита и многие другие.
Грызуны способны годами носить в себе, например, вирусы лимфоцитарного хориоменингита, лихорадки Ласса, бешенства, оспы и др. Это может привести к заболеванию людей, находившихся с ними в контакте.
Так, в Бостоне (США) по просьбе ребенка родители купили сирийского хомяка. Новый жилец отличался склонностью кусать своих хозяев, и очень скоро в семье вспыхнуло заболевание, проявившееся разнообразными симптомами. Врачи определили вспышку лимфоцитарного хориоменингита. При этом у четверых членов семьи болезнь протекала, как это нередко бывает, в гриппоподобной форме и у одного завершилась развитием менингита, а у другого – энцефалита. У двух соседей, приходивших поиграть с хомяком, также развилась гриппоподобная форма лимфоцитарного хориоменингита. При этом у пожилых членов семьи болезнь протекала наиболее тяжело, в то время как у ребенка наблюдали лишь бессимптомную (скрытую) инфекцию, несмотря на самый тесный контакт с хомяком и частые укусы. В одной из больших больниц штата Нью-Йорк (США) были отмечены неоднократные случаи лимфоцитарного хориоменингита среди людей, особенно среди медицинского персонала, посещавшего помещение отдела радиотерапии, где для исследовательских целей содержалось около 200 сирийских хомяков. Именно они оказались скрытыми носителями вируса.
Эти примеры вовсе не означают, что все хомяки или другие грызуны опасны и с ними ни в коем случае нельзя иметь дело. Вовсе нет! Но если вы надумаете порадовать ребенка подарком, то избегайте покупки "с рук". Гораздо лучше приобретать животных в зоомагазинах, где они проходят предварительный строгий ветеринарный контроль.
Еще много лет назад на территории нашей страны в районах Крайнего Севера было известно заболевание, которое называли "дикованием" животных. Причина болезни долгое время была неизвестна, но клиническая картина очень напоминала бешенство. Молодой исследователь Р. А. Канторович в течение нескольких лет проводил в тундре массовые вирусологические обследования различных видов животных и птиц, у которых не было никаких признаков заболевания. Ученый организовывал отлов песцов, лисиц, волков, собак, горностаев, мышевидных грызунов и сов и кропотливо изучал их внутренние органы. В результате из мозга здоровых песцов и лисиц ему удалось выделить вирус "дикования", который оказался не чем иным, как действительно вирусом… бешенства!
Продолжая свою работу, исследователь обнаружил очень важную закономерность: во время вспышек "дикования" вирус бешенства удавалось выделять у 50–75 % внешне здоровых песцов, в то время как в период спада болезни – лишь у 3-10 % здоровых животных. Полученные данные прямо указывали на ведущую роль песцов в сохранении вируса бешенства на территории Заполярья.
В Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского (Москва) в 1958 году были получены весьма любопытные результаты. С. Я. Гайдамович, заражая вирусом бешенства петухов и голубей, наблюдала у них формирование скрытой инфекции, которая поддерживалась на протяжении 70 дней. Почти одновременно ее коллега И. А. Шумейкина обнаруживает и описывает скрытую инфекцию бешенства у крыс. Вирус бешенства до 78-го дня не только сохраняется в головном мозге зараженных (и не проявляющих признаков заболевания) животных, но и все это время выделяется со слюной.
Скрытыми носителями вируса бешенства оказались летучие мыши, особенно часто – кровососущие летучие мыши (вампиры), обитающие в Бразилии, Мексике и Аргентине. Доказано, что вампиры могут быть здоровыми вирусоносителями в течение очень долгого времени, передавая вирус (и тем самым вызывая заражение) через укусы.
Наиболее тщательному обследованию подверглись обезьяны. Повышенный интерес к этим животным объяснялся просто: почки обезьян стали использовать для приготовления из их ткани клеточных культур, которые нашли широкое применение в промышленном производстве полиомиелитной вакцины. Из организма внешне здоровых обезьян было выделено огромное число вирусов: аденовирусы, вирусы герпеса, вирусы группы оспы, парагриппозные и многие другие. Среди прочих был выделен даже вирус кори, однако лишь после того, как обезьяны какое-то время контактировали с людьми; обследование обезьян сразу после их отлова никогда не выявляло у них коревого вируса. Ученые заподозрили причастность людей в передаче животным данного вируса, хотя механизм заражения оставался неясным. Объяснить его удалось лишь через 7 лет после первых наблюдений.
Оказалось, что люди, в детстве переболевшие корью, могут на протяжении многих лет оставаться здоровыми вирусоносителями, сохраняющими вирус кори в лимфатических узлах и в селезенке. Поэтому обезьянам, чтобы заразиться вирусом кори, нет необходимости контактировать с больным человеком, им вполне достаточно встретиться со здоровым вирусоносителем.