Поскольку амплитуда ВП (5–15 мкВ) гораздо меньше амплитуды ЭЭГ в состоянии бодрствования (20–70 мкВ), то для выделения ВП проводят усреднение сигнала: стимул предъявляется несколько раз, после чего компьютер суммирует отрезки ЭЭГ, которые следуют сразу после предъявления стимула. В результате постоянные компоненты ВП суммируются и выделяются, а "случайные" компоненты ЭЭГ, наложившиеся на запись во время регистрации ВП, нивелируются. Следует отметить, что соотношение сигнал/шум при выделении ВП из ЭЭГ находится в прямой зависимости от квадратного корня из количества поданных стимулов. Например, если средняя амплитуда ЭЭГ при записи ВП составляет 50 мкВ, то после 25 поданных сигналов уровень шума уменьшится до 10 мкВ, после 50 поданных сигналов – до значения около 7 мкВ, после 100 – до 5 мкВ и т. д. Так как при получении когнитивных ВП зачастую используются несколько различных типов сигналов, то для четкого выделения ВП на конкретный тип стимула следует учитывать не общее количество поданных сигналов, а количество поданных сигналов этого типа. Рекомендуется для выделения компонентов с высокой амплитудой подавать 50–60 стимулов, со средней амплитудой – 200–300, с низкой – более 500.
Кроме электроэнцефалографии для регистрации ВП используют также магнитоэнцефалографию (МЭГ).
Различают зрительные ВП (ЗВП), аудиторные ВП (АВП), соматосенсорные ВП (СВП), связанные с событиями ВП (ССВП, в английском варианте – event-related potential ERP), когнитивные ВП (КВП), которые являются частным случаем ССВП и моторные ВП (МВП).
Характеристиками вызванных потенциалов являются латентный период (латентность), амплитуда (или площадь), полярность (негативная/позитивная) и форма.
Для диагностических целей наибольшее применение получили коротколатентные аудиторные, соматосенсорные, зрительные и моторные ВП. Например, стволовые АВП (Brainstem auditory evoked potentials) используются в качестве стандартного нейрофизиологического теста для исследования поражений ствола мозга и объективной оценки нарушений слуха. Соматосенсорные и моторные ВП позволяют выявить и оценить степень нарушения функции проводящих путей спинного мозга. Зрительные ВП имеют важное значение в диагностике рассеянного склероза.
В научной практике ВП первоначально выступали как основа для анализа реакций мозга на внешние стимулы, в дальнейшем стали использоваться и для анализа внутренне обусловленных нервных процессов. На основании данных, полученных с помощью этого метода, строятся гипотезы относительно восприятия, внимания, интеллекта, функциональной асимметрии мозга и индивидуальной психофизиологической дифференциации. В частности, могут быть зафиксированы биоэлектрические колебания, связанные с активностью двигательной коры (моторный потенциал), с окончанием движения, с состоянием намерения произвести какое-либо действие (Е-волна), пропуска ожидаемого стимула. Форма, амплитуда и латентный период колебаний длиннолатентных вызванных потенциалов обусловлены местом локализации регистрирующего электрода, модальностью и интенсивностью стимула, состоянием и индивидуальными особенностями индивида.
Психогенетические исследования самостоятельных психологических характеристик проводились в соответствии с теоретическими представлениями дифференциальной психофизиологии, что проявлялось в ориентации на динамические, а не на содержательные характеристики – в основном исследовались особенности общительности, тревожности и эмоциональности.
С начала 1980-х годов психологическая проблематика меняется: основным предметом исследования становятся когнитивные характеристики – интеллект и когнитивные способности. Экспериментальные исследования проводятся как совместный психогенетический анализ психологических и психофизиологических характеристик – рассмотрение психофизиологических характеристик как звена между генотипом и психологическими особенностями. Также обсуждается вопрос о специфике психофизиологических и психологических признаков человека, включаемых в генетическое исследование, в связи с тем, что появилось достаточно данных о зависимости механизмов наследственной детерминации психологических и психофизиологических признаков от их психологической структуры. Исследованиями было установлено, что генетический контроль параметров сенсомоторной деятельности обнаруживается лишь на уровне высокой автоматизации навыка – генетический контроль параметров, например, зрительных ВП меняется в зависимости от экспериментальной ситуации, в которую включен исследуемый параметр. Исследование генетической обусловленности целостных (системных) психофизиологических образований (оборонительная и ориентировочная реакции) подтвердило зависимость характера наследственной детерминации от специфики исследуемого звена соответствующей реакции. Генетический контроль более выражен, когда движение – средство выполнения, а не цель действия. Отсюда: фенотипически один и тот же психофизиологический признак как признак, имеющий одни и те же внешние проявления, может существенно различаться по психологической структуре и соответственно по соотносительному вкладу генотипических и средовых детерминант в его вариативность. А данные о возрастной динамике генетического контроля поведения человека тоже свидетельствуют о зависимости наследственной детерминации от психологической структуры изучаемого признака, поскольку механизмы реализации психологической функции меняются в онтогенезе – на разных этапах онтогенеза одной и той же психической функции влияние генетических факторов оказывается различным, что (согласно исследованиям А. Р. Лурии) связано с качественной перестройкой психической деятельности ребенка.
Психологический институт Российской академии образования в 1986 г. организовал первое в нашей стране лонгитюдное (долговременное) исследование близнецов, задуманное как попытка подойти к решению одного из основных вопросов возрастной психологии – вопроса о том, какие факторы, генетические или средовые, и в какой степени обеспечивают преемственность развития. Это исследование продолжается и до сих пор.
Вопросы и задания по теме 3
1. Подготовьте сообщения об истории создания и деятельности Русского евгенического общества.
2. Подготовьте сообщения о жизни и научной деятельности Н. К. Кольцова.
3. Расскажите о начале изучения близнецов в России, методе исследования близнецов.
4. Подготовьте сообщения о научной деятельности, жизни и судьбе С. Г. Левита.
5. В чем, по-вашему, заслуги Медико-биологического (Медико-генетического) института перед отечественной / мировой психогенетикой?
6. Расскажите о психогенетических исследованиях лаборатории Теплова-Небылицына.
7. Что такое вызванный потенциал?
Тема 4
Геном человека: проекты, исследования, факты и домыслы
Понятие о геноме.
Генетика мозга. Генные заболевания.
Международный проект "Геном человека".
Вымыслы, предположения, гипотезы.
Развитие молекулярной биологии и генетики человека к середине 80-х годов XX в. сделало возможным и даже, в принципе, необходимым появление такого проекта, как "Геном человека" – к этому времени были уже достаточно разработаны методы изучения генов, которые и легли в основу данного проекта.
Это были методы быстрого определения первичной структуры ДНК, полимеразной цепной реакции (ПЦР), методы клонирования протяженных участков чужеродной ДНК в искусственных хромосомах дрожжей, метод разделения больших фрагментов ДНК электрофорезом в пульсирующем электрическом поле и ряд других. В области генетики человека были разработаны методы локализации генов с помощью анализа наследования признаков с анонимными ДНК-маркерами. Разработан метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, который оказался настолько удачным, что позволил к 1987 г. получить первую карту генома человека.
Идея проекта "Геном человека" была выдвинута в США. В дальнейшем подобные национальные программы были приняты в Великобритании, Франции, Германии, Италии, России.
Картирование генов человека и выяснение нуклеотидной последовательности человеческого генома составляют основные взаимосвязанные задачи Международной программы "Геном человека". Официально эта научная программа с участием ведущих молекулярно-генетических лабораторий США, Западной Европы, России и Японии оформилась в 1990 г. Однако задолго до приобретения официального статуса в этих странах проводились важные молекулярные исследования по изучению генома человека и картированию его генов.
История отечественной программы началась в 1987 г. Ее инициатором и безусловным лидером в течение многих лет был академик А. А. Баев. По его настоянию в 1989 г. она стала одной из ведущих Государственных научно-технических программ СССР. Основные разделы этой программы как в России, так и во всем мире включают три главных направления научных исследований: картирование и секвенирование генома; структурно-функциональное изучение генома; медицинская генетика и генотерапия. Считается, что в итоге этой работы будут идентифицированы все гены человека, т. е. будет точно определено их число, взаиморасположение на генетической карте и структурно-функциональные особенности. Предполагается, что осуществление этого проекта, помимо колоссальных теоретических обобщений для фундаментальных наук, окажет огромное влияние на понимание патогенеза, предупреждение и лечение наследственных болезней, значительно ускорит исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе развития очень многих моногенных нарушений, будет способствовать более эффективному поиску генетических основ мультифакториальных заболеваний и наследственной предрасположенности к таким широко распространенным болезням человека как атеросклероз, ишемия сердца, психиатрические и онкологические заболевания.
Итак, подробнее о проекте "Геном человека".
Цель – выяснение последовательности оснований во всех молекулах ДНК в клетках человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что помогло бы выяснить причины наследственных заболеваний и открыть пути к их лечению. В выполнении проекта задействовано несколько тысяч ученых, специализирующихся в биологии, химии, математике, физике и технике. Это один из самых дорогостоящих научных проектов в истории цивилизации. В 1990 г. на изучение геномов было потрачено 60 млн долларов, в 1991 г. – 135 млн, в 1992–1995 годах ежегодно выделялось от 165 до 187 млн долларов, а в 1996–1998 гг. только США расходовали 200, 225 и 253 млн долларов ежегодно. Чтобы последовательно приближаться к решению упомянутой проблемы картирования генов человека, было сформулировано пять основных целей: 1) завершить составление детальной генетической карты, на которой были бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии, не превышающем в среднем 2 млн оснований (1 млн оснований принято называть 1 мегабаза, сокращенно Мб, от англ. слова base – основание); 2) составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0,1 Мб); 3) получить карту всего генома в виде охарактеризованных по отдельности клонов (5 тыс. оснований в клоне, или 5 килобаз, Кб); 4) завершить (к 2004 г.) полное секвенирование ДНК (разрешение 1 основание); 5) нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека (к 2005 г.). Ожидалось, что, когда все указанные цели будут достигнуты, исследователи определят функции генов и разработают методы биологического и медицинского применения полученных данных.
В ходе проекта создаются последовательно три типа карт хромосом: генетические, физические и секвенсовые. Выявление всех генов, присутствующих в геноме человека, и установление хотя бы примерного расстояния между ними позволили локализовать каждый ген в хромосомах. Такие генетические карты помимо инвентаризации генов и указания места их расположения отвечают на исключительно важный вопрос о вовлеченности генов в образование отдельных признаков организма – многие признаки формируются под контролем нескольких генов, часто расположенных в разных хромосомах, и знание локализации каждого из них будет способствовать лучшему распознаванию законов дифференцировки клеток, органов и тканей, а также лучшему лечению болезней. Еще когда создавалась хромосомная теория наследственности, выяснение положения каждого гена помогло нанести на генетические карты сначала точки дрозофил, затем кукурузы, а после этого и "генетические маркеры" других видов хромосом. Генетический анализ локализации маркеров вдоль хромосом помогал насыщать генетические карты хромосом человека новыми сведениями. Первые данные о положении генов появились еще до 1968 г. Затем знания нарастали, и в настоящее время примерное положение найдено уже для нескольких десятков тысяч генов. Второй тип карт – это физические карты хромосом. Еще в 60-е годы XX в. цитогенетики использовали методы окрашивания хромосом для выявления так называемых бэндов (поперечных полосок) на хромосомах. Полосы можно было увидеть в микроскоп. Установление соответствия полос и генов дало возможность внести в изучение хромосом новые детали. Затем были разработаны методы, позволившие следить за присоединением коротких отрезков радиоактивно-меченых или флуоресцентно-меченых ДНК к хромосомной ДНК. Локализация этих меток повысила разрешение структуры хромосом. Использование метода так называемой флуоресцентной in situ гибридизации (FISH-метод) дало возможность достичь разрешения от 2 до 5 Мб, а потом повысить его (при изучении хромосом делящихся клеток) до 100 Кб. В 1970-х годах научились разрезать ДНК на участки ферментами, узнающими коротенькие отрезки, в которых информация записана в виде палиндромов (перевертышей), читаемых одинаково в обоих направлениях: с начала до конца и с конца до начала. Эти ферменты были названы рестрикционными. С их помощью построили так называемые рестрикционные физические карты, а затем в короткий срок были разработаны другие физические и химические методы, приведшие к увеличению степени разрешения физических карт в сотни раз. Разработка методов изучения точных последовательностей нуклеотидов в ДНК, или методов секвенирования, открыла путь к созданию секвенсовых карт, на которых степень разрешения доведена до своего максимального значения – на этих картах указано положение всех нуклеотидов в ДНК.
Важная часть проекта "Геном человека" – разработка множества революционных методов исследований. Развитые еще до начала выполнения проекта методы (их назвали методами первого поколения) включали применение рестрикционных ферментов; создание гибридных молекул, их клонирование и перенос участков ДНК с помощью векторов в клетки-доноры (чаще всего в клетки кишечной палочки и т. д.); синтез ДНК на матрицах информационной РНК; методы секвенирования генов; получение практически неограниченного количества копий генов с помощью PCR-машин (амплификация участков ДНК in vitro); методы, предназначенные для разделения молекул ДНК по плотности, массе, различной вторичной структуре и пр. В последние годы развиваются новые методы (так называемого второго поколения), которые включают как главный компонент автоматизацию большинства процессов.
За последние несколько лет созданы огромные международные банки данных о последовательностях нуклеотидов в ДНК разных организмов (такие, как GenBank / EMBL / DDBJ) и о последовательностях аминокислот в белках (PIR / SwissPot). Любой специалист в мире может практически беспрепятственно войти в эти банки данных и воспользоваться для исследовательских целей собранной там информацией. Решение о доступности информации, надо заметить, было принято не сразу, потребовалась значительная работа и самих ученых, и юристов, и законодателей, чтобы воспрепятствовать первоначальному желанию коммерческих организаций патентовать все получаемые последовательности генов, закрыть их для доступа и коммерциализировать эту научную область.
Кратко скажем о результатах:
– организмы с полностью секвенированными геномами. Решение сначала более простых задач с постепенным их усложнением, обучением персонала, разработкой технологий – таким был путь исследователей, приступивших к разработке проблемы генома человека. Первой крупной вехой стало полное картирование в 1995 г. генома бактерии Hemophilus influenzae. В 1996 г. было закончено картирование ДНК дрожжевой клетки (12,5 Мб, 6 тыс. генов), в середине декабря 1998 года был полностью картирован геном круглого червя Caenorhabditis elegans (97 Мб и 19 099 генов, что составляет от 1/3 до 1/4 общего числа генов человека);
– изученные гены человека – с января 1995 до января 1996 г. длина участков ДНК человека, для которых была установлена полная последовательность оснований, увеличилась почти в 10 раз. Но хотя прогресс виден, все, что сделано за год, составляло менее одной тысячной процента человеческого генома. К июлю 1998 г. было секвенировано почти 9 % всего генома, а затем каждый месяц приносил новые замечательные результаты. Параллельно изучено большое число копий генов, их последовательности сопоставлены с участками хромосомной ДНК, к 23 октября 1998 г. установлены последовательности 30 181 гена человека. К 11 ноября того же года число секвенированных генов достигло 30 261. Тем самым получена информация примерно для половины всех генов человека;