Рис. 20. Прохождение ДНК через нанопору. В мембране, разделяющей ячейку на две половины, проделано отверстие диаметром около 4 нм. Это и есть нанопора. В обеих половинах ячейки находится солевой раствор (диссоциированные ионы соли обозначены точками), но молекулы ДНК первоначально находятся только в той половине, к которой приложено отрицательное напряжение. Ток в ячейке измеряется амперметром (А)
Основу нанопор-секвенатора составляют миниатюрные камеры, к которым подведено электрическое напряжение (рис. 20). Камера разделена на две части при помощи очень тонкой мембраны и заполнена буфером, т. е. подсоленной водой с определенным значением pH. В одну из двух половин, ту, к которой подключен «—» постоянного тока, вводится одноцепочечная ДНК. В мембране сделана малюсенькая дырка диаметром в несколько нанометров, одна на всю мембрану, которая и есть та самая нанопора. Если никаких молекул ДНК в камере нет, через камеру протекает ток определенной силы, вызванный прохождением ионов соли сквозь мембрану, через нанопору. Если ввести молекулу ДНК, то, подобно ситуации с электрофорезом, которую мы уже обсуждали в этой главе, ДНК начнет мигрировать от отрицательно к положительно заряженной половине камеры. После многочисленных неудачных попыток ДНК начнет пролезать через нанопору. Что будет с током? Он упадет, ведь пока молекула ДНК пролезает сквозь нанопору, она блокирует существенную часть поперечного сечения нанопоры, и ионам остается меньше места для прохождения сквозь мембрану, электрическое сопротивление мембраны увеличивается, и, соответственно, ток падает. Чтобы сделать из нанопоры секвенатор, надо было добиться, чтобы ток, протекающий через нанопору, зависел от того, какая последовательность нуклеотидов проходит в данный момент сквозь нанопору.
Добиться этого оказалось очень трудной задачей, над которой начиная с середины 1990-х годов, когда впервые возникла идея нанопорового секвенирования, бились многие. Наиболее упорным оказался оксфордский профессор Хаган Бейли. У Бейли была мечта: он представлял себе визит пациента к доктору в XXI веке следующим образом. Прежде чем начать осмотр пациента, доктор просит его плюнуть на флешку, которая является нанопоровым секвенатором, вставляет флешку в порт своего компьютера и только после этого начинает медосмотр. Пока доктор измеряет пациенту давление, кардиограмму, спрашивает о жалобах, в его компьютер загружается полная последовательность нуклеотидов генома пациента. Компьютер сам, при помощи облачных технологий и самых современных баз данных, проводит полный анализ генома пациента на предмет его предрасположенности к различным болезням и т. д. К концу осмотра доктор уже имеет в своем распоряжении все эти данные в виде готовых рекомендаций того, какие дальнейшие тесты пациенту необходимо пройти.
Принципиальным моментом на пути создания нанопорового секвенатора была замена простой дырки в мембране на специальный белок с нанопорой внутри, альфа-гемолизин. Этот белок вырабатывается бактерией в качестве токсина, убивающего живую клетку. Белок представляет собой цилиндр с дыркой вдоль оси, так что, когда он внедряется в клеточную стенку, в стенке появляется дырка, и клетка погибает. Нанопора в гемолизине как раз нужного диаметра, так что однонитевая ДНК в нее пролезает, но с трудом, и разные нуклеотиды блокируют пору в разной степени. Бейли еще несколько изменил аминокислотную последовательность белка при помощи генной инженерии и добился существенного улучшения способности белковой нанопоры различать нуклеотиды, проходящие сквозь нее.
Вторым важнейшим моментом была замена неконтролируемого, случайного прохождения молекул ДНК через пору на контролируемое протягивание молекулы. С этой целью используется ДНК-полимераза. Все-таки без этого фермента обойтись не удалось. Но в отличие от методов «секвенирования посредством синтеза» в случае нанопорового секвенирования ДНК-полимераза используется лишь как молекулярный мотор, который, синтезируя на секвенируемой однонитевой ДНК, как на матрице, комплементарную цепь, протягивает однонитевую молекулу ДНК сквозь нанопору, причем скорость протягивания можно контролировать, так как она зависит от концентрации в растворе предшественников нуклеотидов, нуклеозидтрифосфатов. Само считывание последовательности происходит посредством анализа силы ионного тока, протекающего через белковую нанопору.
Когда создание флешки-секвенатора стало казаться реальным, Хаган Бейли основал компанию Oxford Nanopore Technologies Ltd., которая в 2014 году начала выпуск нанопоровых секвенаторов. И все-таки осуществить свою мечту Хагану Бейли не удалось. Несмотря на все усовершенствования, нанопоровый секвенатор делает слишком много случайных ошибок, чтобы им можно было секвенировать геном человека. Но есть задачи, для которых он оказался очень даже пригоден. Если секвенируемый геном небольшой, скажем вирусный, то случайные ошибки не так страшны, их можно исправить многократным прочтением той же ДНК. Зато флешку-секвенатор очень удобно использовать в полевых условиях, вдали от цивилизации. Это преимущество нанопорового секвенатора ярко проявилось во время эпидемии вируса Эболы, вспыхнувшей в Африке в 2013 году и свирепствовавшей два года. Геном вируса Эболы содержит всего 19 тысяч нуклеотидов, так что он очень удобен для нанопорового секвенирования. В 2015 году большая международная команда прибыла в Африку, вооружившись флешками-секвенаторами, и провела огромную работу по выявлению всевозможных мутантных вариантов генома вируса, возникших в ходе эпидемии.
И все же последовательности крупных геномов, включая человеческие геномы, которыми с невероятной скоростью пополняются базы данных, получают с помощью методов, основанных на «секвенировании посредством синтеза», главным образом на секвенаторах «Иллюмины». Только используя в полной мере ДНК-полимеразу, необыкновенно точный инструмент, созданный Природой за миллиарды лет биологической эволюции, удается прочесть последовательности ДНК любых геномов.
После прошедшего за первые 15 лет XXI века радикального удешевления секвенирования геномов доктора получают в свое распоряжение не только полный геном пациента, но, в случае злокачественной опухоли, полные геномы различных клонов раковых клеток, из которых опухоль состоит. Это открывает путь для возникновения и развития персонифицированной медицины, в том числе для совершенно новых подходов к терапии раковых заболеваний, о чем пойдет речь в главе 11.
6 Откуда берутся гены?
Теория эволюции и генетика
Между генетикой и теорией эволюции всегда были довольно сложные отношения. Эти науки опираются на весьма надежные, но принципиально различные методы исследования. Эволюционная теория выросла из анализа всего многообразия живущих на Земле существ. Это наблюдательная наука, подобная астрономии. В отличие от нее, генетика носит сугубо экспериментальный характер и весьма схожа с физикой. (Не случайно основоположник генетики Грегор Мендель получил солидное физическое образование – он учился у К. Доплера.) Нет нужды доказывать, что наблюдательная наука, вообще говоря, очень сильно уступает в скорости и возможностях развития науке экспериментальной. Достаточно сравнить прогресс в эволюционной теории и в генетике, достигнутый за последние 100 лет. Конечно, в действительности между наблюдательной и экспериментальной науками нет и не должно быть соревнования. Их уместнее уподоблять супружеской чете, а не двум спортсменам на дистанции. Но, как и между супругами, между ними, конечно, возможны разногласия, а порой даже бурные споры.
По мере того как множились успехи генетики (особенно с переходом ее на молекулярный уровень), все более разрастался конфликт между нею и теорией эволюции, конфликт, который возник еще в начале ХХ века. Суть его состоит в следующем.
Теория эволюции зиждется на двух китах: изменчивости и отборе. Генетика как будто вскрыла механизм изменчивости – в его основе лежат точечные мутации в ДНК. Но та ли это изменчивость, которая способна объяснить эволюцию? Прозорливые умы уже довольно давно поняли, что на такой изменчивости далеко не уедешь. Все новое, что мы узнали в ходе развития молекулярной генетики, подтвердило эти сомнения.
В самом деле, точечные мутации приводят к заменам отдельных аминокислот в белках, в частности, ферментах. Слово точечная означает, что в результате мутации может быть заменен только один аминокислотный остаток в одном из белков целого организма. Мутации чрезвычайно редки, и одновременное изменение даже двух аминокислотных остатков в одном белке совершенно невероятно. Но к чему может привести одиночная замена? Она либо окажется нейтральной, т. е. не повлияет на функцию фермента, либо ухудшит его работу.
Это то же самое, что приделать к автомобилю хвост от самолета. Автомобиль не полетит, но ездить еще будет (правда, несколько хуже). Такова нейтральная мутация. А если приделать к автомобилю правое крыло, то он опять-таки не полетит, но и ездить на нем вы не сможете: будете задевать за все фонарные столбы. Или вам придется ездить по левой стороне дороги, что очень скоро приведет к катастрофе. Кстати, с левым крылом тоже далеко не уедешь, да и полететь шансов мало.
Ясно, что превратить автомобиль в самолет просто так не удастся, нужна радикальная переделка всей машины. То же самое и с белком. Чтобы превратить один фермент в другой, точечными мутациями не отделаешься – придется существенно менять аминокислотную последовательность.
Отбор в этой ситуации не помогает, а, наоборот, очень сильно мешает. Можно было бы думать, что, последовательно заменяя по одному аминокислотные остатки, удастся в конце концов сильно переделать всю последовательность, а значит, и пространственную структуру фермента. Однако в ходе этих малых изменений неизбежно наступит время, когда фермент уже перестанет выполнять свою прежнюю функцию, но еще не начнет выполнять новую. Тут-то отбор его и уничтожит – вместе с несущим его организмом. Придется все начинать сначала, причем с теми же шансами на успех. Как преодолеть эту пропасть? Как сделать, чтобы старое не отбрасывалось до тех пор, пока создание нового не будет завершено?
Классическая генетика не могла предложить модель, которая допускала бы испытание новых вариантов без полного отстранения старых. Это и создало острый конфликт между генетикой и эволюционной теорией.
Успехи в исследовании генетической организации бактерий усугубили конфликт. Бактерии посредством плазмид довольно охотно обмениваются уже имеющимися генами. Это придает им способность быстро меняться. Взять, например, гены устойчивости к антибиотикам. Эти гены вовсе не возникают вновь и вновь у каждой бактерии, которая «привыкает» к данному антибиотику, как думали когда-то, а попадают к ней в готовом виде извне вместе с плазмидой.
Может быть, так же, на основе перегруппировки готовых генов, можно объяснить изменчивость и у высших организмов? Но тогда получается, что гены возникли однажды, раз и навсегда, а эволюция только тасует их как колоду карт. Новые признаки – это лишь новые комбинации старых генов. Самое неприятное в этой схеме то, что она вроде бы объясняет весь комплекс наблюдений, на котором базируется эволюционная теория. И многовековой опыт селекционеров ни в коей мере не противоречит этому. Все, что ими достигнуто, – это результат перетасовки генов, заранее заготовленных природой.
Природа сама часто использует вновь и вновь в разных организмах однажды найденный белковый дизайн, причем подчас для совершенно разных целей. Один такого рода пример – белок, отвечающий за нашу способность видеть, родопсин. Этот белок, находящийся в сетчатке глаза, поглощает свет и посылает соответствующий сигнал в мозг. Множество таких сигналов, поступающих от различных молекул родопсина в сетчатке, создают зрительный образ в нашем мозгу. Неудивительно, что молекулы родопсина из разных видов организмов, имеющих глаза и мозги, устроены одинаково. Но поразительно то, что практически точно такая же молекула, названная бактериородопсином, встречается у бактерий, не имеющих ни глаз, ни мозгов. Эта молекула выполняет тоже очень важную функцию, хотя и совершенно другую, чем родопсин. Вместо того, чтобы посылать сигналы из глаза в мозг, бактериородопсин снабжает бактерию энергией, будучи ключевым белком в сложном процессе превращения энергии света в химическую энергию АТФ.
Чем больше мы узнаем о генах и их функциях в разных, организмах, тем больше накапливается подобных примеров. Но вместе с тем остается без ответа главный вопрос – откуда все-таки взялись сами эти гены? Возможно, бактериородопсин возник сотни миллионов лет назад и Природа позднее воспользовалась готовым удачным дизайном световой антенны при создании нового хитроумного устройства – глаза. Или наоборот, сначала возник глаз с родопсином, а затем некоторые бактерии воспользовались удачным дизайном для своих целей.
Итак, дарвиновский вопрос о происхождении видов превращается в вопрос о происхождении генов. Может быть, на свете есть фабрика, на которой делаются новые гены, проверяются и отбраковываются негодные? А может быть, такое производство существовало когда-то, на ранних стадиях эволюции, а потом, наработав огромный набор генов, отмерло? Конечно, было бы куда приятнее, если бы эти живые фабрики генов сохранились до сих пор и их удалось бы обнаружить.
Так что же, давайте снаряжать экспедиции, заранее занеся некие диковинные реликтовые существа в Красную книгу? Вот и название уже готово – геногены!
Расчлененные гены
Но не будем торопиться. Если окажется верной гипотеза, выдвинутая У. Гилбертом (это тот самый Гилберт, который участвовал в разработке химического метода чтения ДНКовых текстов, за что был удостоен Нобелевской премии по химии вместе с Сэнгером в 1980 году), то далеко отправляться на поиски нам не придется. И нового названия тоже не потребуется. «Геногены» это не что иное, как эукариоты. Если яснее не стало, то, пожалуйста, это мы с вами! К эукариотам принадлежим не только мы с вами. К ним относятся вообще все высшие организмы: и животные, и растения, и даже некоторые простейшие. Так что если предположение Гилберта справедливо, то недостатка в фабриках генов нет и быть не может, пока есть жизнь на Земле.
Следует признать, что упомянутая гипотеза возникла не от хорошей жизни. Она потребовалась для того, чтобы объяснить совершенно неожиданные факты, обнаруженные после того, как были определены первые же последовательности ДНК, выделенные из высших.
Совершенно естественно, что поскольку аминокислотная последовательность в белках непрерывна, то непрерывной считалась и последовательность нуклеотидов в генах. Многочисленные исследования на бактериях и бактериофагах показали, что это действительно так.
Исследовать детальную структуру генов у высших и их вирусов стало возможным лишь с появлением генной инженерии и после разработки методов чтения ДНКовых текстов. Каково же было изумление и замешательство ученых, когда в 1977 году выяснилось, что гены у высших организмов не непрерывны, а состоят из отдельных кусков, разделенных какими-то другими последовательностями нуклеотидов! ДНК вдруг предстала этаким винегретом из генов, порубленных на части. Когда Ричард Робертс (работавший в то время в возглавлявшейся Уотсоном Колд-Спринг-Харборской лаборатории в окрестностях Нью-Йорка, на Лонг-Айленде) и Филип Шарп (Массачусетский технологический институт) независимо пришли к такому выводу, изучая геном одного из вирусов, вызывающих обычную простуду (аденовирус), это было воспринято в качестве курьеза. Однако затем выяснилось, что так же устроены и глобиновый ген у кролика, и овальбуминовый ген у цыпленка, и гены рибосомальной РНК у плодовой мушки дрозофилы. Короче, так оказались устроены почти все гены высших организмов. За открытие расчлененных генов Робертс и Шарп были в 1993 году удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.
Промежутки между кусками генов бывают разными – от десятков до многих тысяч пар оснований. Как же на таких расчлененных генах синтезируются единые молекулы мРНК, по которым далее идет синтез единых молекул белков? Оказалось, что с участка ДНК, по которому разбросаны куски данного гена, включая и промежутки, снимается копия в виде очень длинной молекулы РНК. Эта молекула-предшественник или, как говорят, про-мРНК. Из про-мРНК сложным путем нарезания и последующего сшивания (этот процесс иногда называют «созреванием») получаются «зрелые» молекулы мРНК, которые уже могут выполнять свои прямые обязанности. Таким образом, сам факт расчлененности генов заставляет высшие организмы заботиться о «созревании» мРНКовых копий. Отметим, что в зачаточном (или, наоборот, в рудиментарном) виде механизм созревания РНК есть и у бактерий, но там дело ограничивается отрезанием «лишних» концов у молекул.
Как в деталях идет процесс созревания? Конечно, существуют специальные ферменты, разрезающие молекулу про-мРНК и сшивающие полученные фрагменты друг с другом. Но что указывает ферменту, как правильно нарезать молекулу и как правильно сшить получившиеся куски мРНК? И как выбрасываются промежуточные участки? Кухня такой рубки-сборки совсем не проста: ведь если фермент просто разрежет мРНК на куски, то эти куски разбегутся в разные стороны из-за броуновского движения – и пойди собери их!
Как удалось установить, в процессе «созревания» или, как его принято называть, сплайсинга мРНК участвуют специальные коротенькие молекулы РНК. Они «склеивают» про-мРНК так, чтобы специальным ферментам было ее удобно нарезать на куски и вновь сшить, выбросив лишнее. С легкой руки Гилберта те участки ДНК, слепок с которых сохраняется в ходе сплайсинга, называют экзонами, а выбрасываемые в ходе сплайсинга участки – интронами.