Hox-гены располагаются на одной или нескольких (до четырех) хромосомах, обычно тесными группами (кластерами), внутри которых сохраняется более или менее строгий порядок: «головные» гены впереди, «хвостовые» — сзади. У более примитивных представителей многоклеточных, таких как гребневики (Ctenophora) и кишечнополостные (Cnidaria), этих эмбриональных регуляторных генов только четыре, у млекопитающих их уже 48.
Семейство Hox-генов подразделяется на 14 классов. Считается, что эти 14 классов возникали путем дупликации (удвоения) одного или немногих исходных генов. «Дубликаты» затем мутировали и обретали новые функции. У примитивных кишечнополостных и гребневиков имеется всего 4 класса Hox-генов, у предполагаемого общего предка двусторонне-симметричных животных их должно было быть по крайней мере 8, у млекопитающих присутствуют все 14 классов.
Принцип работы всех Hox-генов одинаков. Все они являются транскрипционными факторами (регуляторами транскрипции — «прочтения» генов), то есть их функция состоит во «включении» или «выключении» других генов. В результате работы Hox-факторов запускается каскад реакций, приводящий к появлению в клетке нужных белков.
Обобщенная схема эволюции основных групп многоклеточных животных. Внизу показано предполагаемое строение Hox-кластера у общего предка билатеральных животных. У него предположительно имелось 8 Hox-генов в едином кластере. Гены нарисованы разными цветами и пронумерованы. Цифры дробью указывают, что данные гены совмещены, то есть еще не разошлись в ходе эволюции. Некоторые гены показаны одинаковым цветом, это означает большое сходство в их нуклеотидных последовательностях. Стрелочки указывают направление считывания генов на ДНК.
В последние годы представления о Hox-генах существенно изменились и расширились. Этому способствовала расшифровка ДНК-последовательностей Hox-генов у многих групп животных: кольчатых, плоских и круглых червей, иглокожих, членистоногих, оболочников, ланцетников, не говоря уже о млекопитающих. Под тяжестью новых данных обрушилось представление об упорядоченном расположении Hox-генов в хромосомах. Выяснилось, что, например, у иглокожих первые три Hox-гена располагаются прямо перед последним (14-м), а начинается кластер с пятого гена. У круглых червей и оболочников Hox-гены вообще не образуют кластеров и их порядок в хромосомах не соблюдается вовсе. Это говорит о том, что правильный порядок экспрессии («включения») Hox-генов в различных частях эмбриона не обязательно должен соответствовать порядку расположения этих генов в хромосоме. Последовательность включения Hox-генов зависит помимо «места под солнцем» от ряда дополнительных факторов, которые сейчас активно изучаются (но выяснить пока удалось немногое).
Число классов Hox-генов в разных типах животных оказалось разным. Завораживающее сходство Hox-кластеров у мухи и человека тускнеет, лишь только к ним прибавляется еще какая-нибудь группа двусторонне-симметричных животных. Так, у круглых червей (нематод) найдено всего 5 классов из 14, у оболочников — 9, зато у ланцетника — все 14. У паразитических трематод (класс плоских червей) обнаружено всего 4 Hox-гена на двух хромосомах, и между этими четырьмя разбросаны другие гены, не связанные с Hox-семейством.
И вот вопрос: почему у двусторонне-симметричных плоских червей Hox-генов столько же, сколько и у радиально-симметричных кишечнополостных и гребневиков? У кишечнополостных — вроде бы понятно: недостающих четырех классов генов еще не было, они образовались только после того, как появился гипотетический предок двусторонне-симметричных животных. Но у червей-то куда делась половина предковых регуляторных генов, зачем они избавились от них? Или, может быть, этой недостающей половины не было и у предка? Ответа пока нет. Ясно только, что даже при потере большого числа Hox-генов оставшиеся могут организовать эмбриональное развитие сложного билатерального существа.
Зато стали известны детали регуляции самих регуляторных Hox-генов. Между Hox-генами расположены участки ДНК, прежде считавшиеся бессмысленными. В действительности, как оказалось, с них считываются короткие молекулы регуляторных РНК. Некоторые из них усиливают или ослабляют экспрессию (работу) самих Hox-генов, некоторые косвенно влияют на работу других транскрипционных факторов. В экспериментах показано, что эти микроРНК могут регулировать как соседний, так и отдаленный Hox-ген.
Так что семейство Hox-генов, главное из главных среди генов-регуляторов, само не имеет полной власти в своем хозяйстве. За ним следят мелкие «выскочки» РНК, способные видоизменить экспрессию гена и тем самым замедлить или ускорить формирование органа.
(Источник: Derek Lemons, William McGinnis. Genomic Evolution of Hox Gene Clusters // Science. 2006. V. 313. P. 1912–1922.)
—————
Пожалуй, самый главный вывод, который можно сделать на основе анализа генома актинии, состоит в том, что уже самые первые представители животного царства обладали весьма сложным и совершенным «набором рабочих инструментов», то есть генов, который позволил создать огромное разнообразие сложных многоклеточных организмов, внося лишь небольшие изменения в базовую программу развития. Более того, эти изменения, судя по всему, вносились не в «архитектуру» программы, а только в ее «настройки».
Базовая генетическая программа поведения клетки, имевшаяся уже у первых животных, оказалась столь удачной и гибкой, что дальнейшая эволюция животного царства — в том числе и прогрессивная эволюция, связанная с усложнением организма, — уже почти не требовала радикальных изменений самой программы. Достаточно было лишь небольших изменений в «настройках». Менялись, в частности, регуляторные участки ДНК, от которых зависит тонкая настройка работы генов-регуляторов.
—————
«Главный секрет» животных. На интуитивном уровне мы привыкли относиться к царству животных как к чему-то огромному и чуть ли не бесконечно разнообразному. Но в последнее время все больше появляется фактов, которые показывают, что в действительности животные (Metazoa) представляют собой весьма специфическую, компактную и генетически однородную группу организмов. Прочтенный геном актинии — яркое тому свидетельство.
По-видимому, «самый большой секрет» животных, та генеральная идея, на которой основаны их строение и эволюция, заключается в особой технологии построения сложного организма из множества изначально одинаковых модулей — клеток. Суть технологии в том, что благодаря деятельности ряда ключевых генов — регуляторов развития (в том числе Hox-генов) между делящимися клетками складывается сложная система взаимоотношений, клетки обмениваются сигналами, градиенты концентраций регуляторных веществ задают симметрию и план строения развивающегося организма, и все эти факторы вместе направляют процесс самоорганизации, самосборки сложного многоклеточного существа из генетически идентичных (то есть изначально одинаково «запрограммированных») клеток.
Очень важно помнить, что геном работает не на уровне организма, а на уровне клетки. По сути дела он реально кодирует лишь биохимию и поведение одной клетки. Никакой «программы развития организма» в оплодотворенном яйце нет: там есть программа поведения клетки, не более. Что же касается «программы развития», то она самозарождается из взаимодействия делящихся клеток уже в ходе самого развития (примерно так же, как это происходит у Protozoon).
—————
Развитие червей начинается с хвоста. Нематода (круглый червь) Caenorhabditis elegans — замечательный модельный объект для изучения индивидуального развития животных, равно как и для многих других исследований. Достаточно сказать, что в 2002 году Сиднею Бреннеру, который первым начал использовать этого крошечного червя в качестве модельного объекта в генетике и эмбриологии, была присуждена Нобелевская премия «за открытия в области генетического регулирования развития человеческих органов». Работа, конечно, проводилась на черве, но выводы оказались справедливыми и для человека — вот вам и еще одно доказательство генетического единства животного царства.
Генетики и эмбриологи выявили целый ряд генов, влияющих на развитие червя, причем многие из этих генов имеются также и у других животных, включая человека. Как мы уже знаем, система генетической регуляции развития, включающая Hox-гены и ряд других генов-регуляторов, в общих чертах сходна у всех животных. Однако ученые пока еще очень далеки от полного понимания тех удивительных механизмов, которые заставляют дробящееся яйцо превращаться не в комок клеток, а в сложно и тонко организованное многоклеточное существо.
Червь Caenorhabditis elegans — любимец генетиков и эмбриологов. Одно из главных достоинств С. elegans — прозрачность. Под микроскопом хорошо видны на просвет все внутренние органы и даже отдельные клетки. Чтобы увидеть во всех подробностях, как из оплодотворенной яйцеклетки развивается червячок с пищеварительной и нервной системами, мускулатурой, органами размножения, достаточно просто положить яйцо С. elegans на предметный столик микроскопа и наблюдать за ним в течение 14 часов — именно столько продолжается эмбриональное развитие этого животного.
Генетический анализ позволяет лишь выявить гены, необходимые (но вовсе не обязательно достаточные) для тех или иных аспектов дифференцировки клеток. Например, мутации Hox-генов могут приводить к причудливому перемешиванию признаков, характерных для разных отделов тела (на голове дрозофилы могут вырасти ноги, на заднем сегменте груди — дополнительная пара крыльев). Известны гены, мутации в которых приводят к полному нарушению процессов клеточной дифференцировки, так что вместо нормального эмбриона действительно образуется бесструктурный комок клеток. Но чтобы понять, как все эти гены вместе руководят развитием, необходимы эмбриологические эксперименты.
С. elegans — идеальный объект для таких исследований. Развитие этого червя прослежено во всех деталях — от оплодотворенного яйца до взрослого организма. В точности известна судьба каждой зародышевой клетки (бластомера); известно, из какого бластомера образуется каждая из клеток взрослого червя. Надо сказать, что развитие круглых червей, в отличие от многих других животных, очень строго определено с самого начала. Даже на стадии двухклеточного эмбриона его бластомеры отнюдь не одинаковы. Разделив их, мы не получим близнецов, как это бывает у позвоночных. Более крупный передний бластомер АВ дает большую часть тела, мускулатуру, нервную систему; задний бластомер P1— меньшую часть тела, включая половые органы и кишечник. Таким образом, судьба этих бластомеров известна уже на двухклеточной стадии. Она предопределена изначальной полярностью яйцеклетки: одному бластомеру достается больше каких-то регуляторных (сигнальных) веществ, другому меньше.
При этом, однако, бластомеры вовсе не являются замкнутыми системами, изначально запрограммированными на какой-то определенный путь развития. Они не могут правильно развиваться без контакта с другими бластомерами; они обмениваются между собой разнообразными химическими сигналами, корректируя свое поведение в соответствии с переменами в клеточном окружении.
Маркус Бишофф и Ральф Шнабель из Института генетики Технического университета в Брауншвейге задались целью выяснить, какой механизм отвечает за придание эмбриону передне-задней полярности. В экспериментах им чрезвычайно помогло то обстоятельство, что с ранними эмбрионами С. elegans можно обращаться как с миниатюрным живым конструктором. Бластомеры можно разделять и перекомбинировать произвольным образом и даже составлять химерные эмбрионы из клеток разных особей. До взрослого червя такие конструкции, как правило, дорасти не могут, но все-таки умирают не сразу и некоторое время развиваются.
Исследователи отделили у четырехклеточных эмбрионов две передние клетки («дочки» бластомера АВ), из которых в норме должен развиться почти весь червяк. Лишенные контакта с задними бластомерами («дочками» бластомера P1, которые называются EMS и P2), эти клетки делились хаотически и превращались в аморфный комок без всяких признаков передне-задней полярности.
Естественно было предположить, что задние бластомеры выделяют какое-то сигнальное вещество, упорядочивающее деление передних клеток. Так оно и оказалось. «Поляризующим центром» зародыша, как показали эксперименты, служит c(из него впоследствии развивается половая система). Достаточно приложить клетку P2 к потомкам АВ хотя бы на пять минут, чтобы клетки «поляризовались». После этого потомки АВ делятся не случайным образом, а преимущественно в определенной плоскости, так что в результате из них получается не комок, а удлиненный червеобразный зародыш с выраженным передним и задним концом. Задним концом всегда становится та точка, к которой прикоснулась клетка P2.
Зародыш С. elegans на стадии 8 клеток.
Очевидно, сигнальное вещество, выделяемое клеткой P2, влияет на ориентацию плоскости деления у дробящихся бластомеров. Сила этого вещества такова, что, прикладывая к клеткам два P2-бластомера в разных местах, ученые получали причудливых монстров с двумя хвостами или L-образно изогнутые зародыши с двумя взаимно перпендикулярными передне-задними осями. Каждая точка контакта с P2 превращалась в хвост!
Теперь надо было выяснить, что это за вещество. Ранее было установлено, что на ориентацию плоскости деления клеток оказывает влияние сигнальный белок Wnt, один из важнейших многофункциональных регуляторов развития у животных. Этот белок в иерархии регуляторов стоит в некотором смысле даже выше Hox-генов. Одни клетки выделяют белок Wnt, другие воспринимают его при помощи специальных белков-рецепторов, и это приводит к активизации других генов-регуляторов, в том числе Hox-генов.
Чтобы проверить, действительно ли бластомер P2 поляризует остальные бластомеры при помощи белка Wnt, исследователи использовали мутантные P2-бластомеры с выключенным геном Wnt. Оказалось, что такие P2-бластомеры поляризующим действием не обладают. Таким образом, природа сигнала была установлена.
Оставалось понять, каким образом сигнал передается от одних клеток к другим. Исследователи обнаружили, что клетки, «поляризованные» P2-бластомером, сами приобретают способность поляризовать другие клетки. Однако если у них выключен ген Wnt, этого не происходит. Из этого авторы сделали вывод, что передача сигнала происходит не путем диффузии сигнального вещества, производимого P2-бластомером, из клетки в клетку (как у модельного существа Protozoon из прошлой главы), а по принципу эстафеты. Поляризованные клетки сами начинают производить белок Wnt и таким образом поляризуют своих соседей.
Дополнительные эксперименты показали, что оставшаяся часть зародыша (та, что получается из бластомера EMS) тоже поляризуется благодаря контакту с P2. Таким образом, бластомер P2 оказался главным организующим центром развивающегося зародыша, определяющим его передне-заднюю полярность. Это важное открытие германских эмбриологов, а также разработанные ими методики сложных манипуляций с бластомерами открывают новые захватывающие перспективы перед учеными, стремящимися проникнуть в тайну развития животных.
Данная работа очень наглядно показывает, каким образом довольно простые системы химического «общения» между клетками зародыша позволяют им «самоорганизоваться» в сложный многоклеточный организм.
(Источник: Marcus Bischoff, Ralf Schnabel. A Posterior Centre Establishes and Maintains Polarity of the Caenorhabditis elegans Embryo by a Wnt-Dependent Relay Mechanism // PLoS Biology. 2006. 4(12): e395.)
—————
Нужны ли эмбрионам гены?
Имеется еще одно странное обстоятельство, затрудняющее понимание природы индивидуального развития животных. Оно состоит в том, что ранние этапы онтогенеза, как правило, идут вообще без участия генов, при полностью отключенном геноме.
Задумаемся, что это значит. Ведь принято считать, что индивидуальное развитие — это постепенная «реализация» той генетической информации, которая заключена в геноме оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) и которая в итоге окончательно «воплощается» в строении взрослого организма. Все понимают, что путь от генотипа к фенотипу труден и извилист, но лишь немногие эволюционисты всерьез пытаются объяснить ключевые закономерности эволюции особенностями тех сложнейших процессов самоорганизации, которые составляют суть онтогенеза (уж слишком трудна задача). Поэтому обычно проблему пытаются упростить, сведя все к вопросу о том, каким образом те или иные изменения генотипа (например, мутации) могут отразиться на процессе развития зародыша.
Делящаяся яйцеклетка (слева наверху), морула в виде комка клеток (слева внизу), бластула в виде полого шарика (справа внизу и вверху). На всех этих стадиях развития животных геном обычно не функционирует. На рисунке — развитие медузы Aequorea.
Геном традиционно рассматривается как активное начало (в нем все «закодировано», он «руководит» развитием). Развивающийся зародыш, напротив, считается чем-то вроде пассивного «результата» деятельности генома. Дело несколько осложняется тем, что сам геном в процессе онтогенеза явно не самодостаточен: в разных клетках эмбриона одни гены включаются, другие выключаются в строгой последовательности, определяемой, в частности, химическими сигналами, которыми обмениваются между собой клетки и ткани зародыша. Кто кем управляет, становится не совсем ясно. Некоторые теоретики по этому поводу даже заявляют, что геном — это не «программа развития зародыша», а скорее некий набор инструментов, которыми зародыш пользуется (или не пользуется) по своему усмотрению.