Десятки последующих биохимических исследований в значительной степени подтвердили идею Бухнера. Первым выделенным ферментом стал реннин, образующийся в желудках телят. Древние египтяне хранили молоко в емкостях, сделанных из оболочек желудков телят. Именно им приписывается открытие такого свойства этого странного вещества, как превращение молока в более удобный для хранения сыр. Опыт древних египтян применялся до конца XIX века. В то время желудки крупного рогатого скота высушивали и продавали в аптеках как сычуг. В 1874 году датский химик Кристиан Хансен проходил собеседование, устраиваясь на работу в аптеку, когда случайно услышал заказ на дюжину сычугов. Узнав, что это такое, он решил использовать свои познания в химии для открытия более привлекательного источника сычужного фермента. Он вернулся в свою лабораторию, где разработал метод превращения жидкости, полученной в процессе вымачивания желудков телят и отличающейся весьма неприятным запахом, в сухой порошок и успешно представил свой продукт на рынке под названием «Сычужный экстракт доктора Хансена».
Реннин, или сычужный фермент, представляет собой смесь нескольких различных ферментов. В сыроварении наиболее активно используется фермент химозин, представитель большого семейства ферментов протеаз, ускоряющих расщепление белков. Его роль в производстве сыра заключается в том, что он способствует свертыванию молока, которое затем разделяют на сычужную закваску и сыворотку. Однако в организме молодого теленка данный фермент створаживает молоко, поступающее в желудок, так что оно дольше остается в пищеварительном тракте, увеличивая время всасывания. Коллагеназа также является протеазой, но способ ее выделения оставался неизвестным на протяжении еще 50 лет, пока в 1950-х годах Джером Гросс, исследователь из Гарвардской медицинской школы Бостона, не задался вопросом, как же головастик растворяет свой хвост и превращается в лягушку.
Гросс исследовал функции коллагеновых волокон как пример самоорганизации молекул, в которой, как он считал, «заключается главный секрет жизни»[30]. В качестве образца для исследований он взял огромный хвост головастика лягушки-быка, достигающий в длину нескольких дюймов. Гросс правильно предположил, что процесс реабсорбции должен состоять из многочисленных этапов сборки и расщепления коллагеновых волокон животного. Чтобы определить активность коллагеназы, он разработал простой эксперимент, в ходе которого чашка Петри наполнялась слоем похожего на молоко коллагенового геля, состоящего из прочных, крепких коллагеновых волокон. Помещая фрагменты ткани хвоста головастика на поверхность геля, он отмечал, что в зоне вокруг фрагментов эти прочные волокна расщепляются и превращаются в растворимый желатин. В результате Гросс выделил разрушающее коллаген вещество — фермент коллагеназу.
Коллагеназа присутствует в тканях лягушки и других животных, включая динозавра, утонувшего в Хелл-Крик. Еще 68 миллионов лет назад фермент выполнял ту же функцию, что и сегодня, а именно разрушал коллагеновые волокна. Когда животное погибло и провалилось в болото, фермент утратил свою активность. Тем не менее коллагеновые волокна сохранили свою структуру, пока Мэри Швейцер не добавила немного свежей коллагеназы к костным фрагментам.
Коллагеназа — только один из миллионов ферментов, от которых зависят практически все виды жизнедеятельности животных, микроорганизмов и бактерий. Одни ферменты создают коллагеновые волокна внеклеточного матрикса; другие отвечают за сборку биомолекул — белков, ДНК, жиров и углеводов; наконец, целая группа различных ферментов расщепляет и перерабатывает эти молекулы. Ферменты отвечают за пищеварение, дыхание, фотосинтез и метаболизм. Они создают всех нас. Они поддерживают нашу жизнь. Они — механизмы жизни.
Но являются ли ферменты только биологическими катализаторами, участвуя в химических реакциях наподобие получения серной кислоты и других промышленных веществ? Несколько десятилетий назад большинство биологов согласились бы с мнением Бухнера о том, что химия жизни не отличается от тех процессов, которые можно наблюдать на химических заводах или даже в наборе юного химика. Но в последние 20 лет взгляд на этот вопрос радикально изменился. В ходе нескольких ключевых исследований было сформировано абсолютно новое мнение о работе ферментов. Оказалось, что этим катализаторам жизни покоряются такие глубины, какие не подвластны классической химии, — ферменты творят чудеса и на квантовом уровне.
Чтобы понять, почему для разгадки тайны жизни нам необходима квантовая механика, мы должны сначала узнать, как работают самые простые промышленные катализаторы.
Изменение ландшафта
Катализаторы действуют посредством множества механизмов. Разобраться в этих механизмах помогает теория переходного состояния[31], доступно описывающая то, как катализаторы ускоряют реакции. Чтобы понять теорию переходного состояния, нужно посмотреть на проблему с другой стороны и подумать, зачем для ускорения реакций нужны катализаторы. Ответ прост: почти все химические вещества, окружающие нас, достаточно стабильны и инертны. Они не распадаются мгновенно, не вступают с другими веществами в быструю реакцию. К слову, если бы вещества именно так и поступали, их бы не было вокруг нас.
Причина стабильности привычных соединений заключается в следующем: их связи редко разрушаются вследствие неизбежного турбулентного перемещения молекул, которое всегда происходит в любом веществе. Наглядно это можно представить так: молекулы веществ, участвующие в реакции, должны преодолеть препятствия рельефа, а именно забраться на вершину холма, который находится между ними и превращением в конечный продукт (рис. 3.1).
Рис. 3.1. Молекулы веществ, вступающих в реакцию (на рисунке — точки серого цвета), способны превратиться в молекулы продуктов реакции (на рисунке — точки черного цвета), но сперва они должны преодолеть энергетический «холм». При нормальной температуре молекулы не обладают достаточным количеством энергии для поднятия по склону этого «холма», однако чем выше температура, тем легче молекулы взбираются на его вершину
Энергию, необходимую для того, чтобы взобраться на склон этого «холма», молекулы получают в основном при нагревании. С повышением температуры атомы и молекулы начинают двигаться и совершать колебания быстрее. Подобная толкотня может разрушать химические связи между атомами в молекуле, а также способствовать созданию новых связей. Однако атомы более стабильных молекул (привычных для нашей среды) соединены достаточно крепкими связями, которые устойчивы к турбулентности окружающих молекул. Итак, химические соединения, окружающие нас, устойчивы благодаря тому, что их молекулы в основном стабильны[32], несмотря на их же активную толкотню.
И все же даже стабильные молекулы разрушаются, если для разрыва связи между атомами достаточно энергии. Один из источников энергии, разрушающей молекулы, — дополнительная теплота, ускоряющая их движение. При нагревании химического соединения его внутримолекулярные связи в конце концов разрушаются. Вот почему нам так часто приходится готовить еду на плите: при нагревании ускоряются химические реакции, благодаря которым сырые ингредиенты (вещества, участвующие в реакции) превращаются в съедобные продукты.
Чтобы понять, как теплота ускоряет химические реакции, обратимся к удобному наглядному примеру. Представьте, что молекулы исходного соединения — это песчинки в левом сосуде песочных часов, лежащих на боку (рис. 3.2, а).
Рис. 3.2. Смена энергетического ландшафта: а) молекулы могут перейти из сосуда с исходным веществом в сосуд с продуктом реакции, однако им необходима дополнительная энергия для достижения переходного состояния (чтобы попасть в горловину часов); б) если приподнять левый сосуд часов, молекулы исходного вещества (субстрата) приходят в состояние с большей энергией по сравнению с продуктом, что позволяет им легко проникать в правый сосуд; в) ферменты стабилизируют переходное состояние, снижая энергетический барьер (расширяя горловину наших часов), упрощая превращение молекул субстрата в молекулы продукта реакции. На рисунке R (reactants) — вещества, участвующие в реакции; P (products) — продукты реакции
Если оставить часы в состоянии покоя, никак на них не воздействуя, песчинки так и останутся лежать в левом сосуде до скончания веков, поскольку они не обладают достаточной энергией, чтобы преодолеть узкую горловину и попасть в правый сосуд, символизирующий конечный продукт реакции. Молекулы исходного вещества, участвующего в химической реакции, могут получить дополнительную энергию при нагревании. Они начинают двигаться и совершать колебания с более высокой скоростью, что позволяет некоторым из них превращаться в молекулы продукта реакции. Представим, будто кто-то хорошенько встряхнул наши песочные часы и некоторые молекулы-песчинки в результате попали из левого сосуда в правый, превратившись в молекулы продукта реакции (см. рис. 3.2, б).
Еще один способ превратить субстраты в продукты заключается в том, чтобы снизить энергетический барьер, который должны преодолеть молекулы исходного вещества. Именно этим и занимаются катализаторы. Они расширяют горловину песочных часов и позволяют песку из левого сосуда беспрепятственно и с минимальными усилиями проникать в правый сосуд (см. рис. 3.2, в). Таким образом, ход реакции значительно ускоряется благодаря способности катализатора менять форму энергетического ландшафта и таким образом позволять субстратам[33] гораздо быстрее превращаться в продукты.
Поговорим подробнее о том, как это работает на молекулярном уровне. Для начала рассмотрим медленную реакцию, в ходе которой молекула коллагена расщепляется в отсутствие фермента коллагеназы[34] (рис. 3.3).
Рис. 3.3. Белки — например, коллаген (а) — состоят из цепочек аминокислот, в состав которых входят атомы углерода (C), азота (N), кислорода (O) и водорода (H), связанные пептидными связями. Одна из этих связей обозначена на рисунке жирной линией. Взаимодействуя с водой (H2O), пептидная связь может подвергаться гидролизу и разрушаться (в), однако реакция сначала должна пройти через неустойчивое переходное состояние, при котором возникают по крайней мере две различные структуры, способные превращаться друг в друга (б)
Как мы уже говорили, молекула коллагена представляет собой цепь из аминокислот, которые крепятся друг к другу посредством пептидной связи (на рисунке обозначена жирной линией), возникающей между атомами углерода и азота. Пептидная связь — лишь один из нескольких видов связей, благодаря которым атомы соединяются в молекулы. Она состоит из пары электронов, которую делят между собой атомы азота и углерода. Эти общие для двух атомов отрицательно заряженные электроны притягивают положительно заряженные ядра атомов с обеих сторон связи и представляют собой своего рода электронный клей, соединяющий атомы в пептидной связи[35].
Пептидные связи весьма устойчивы. Чтобы разрушить их, разъединив общую электронную пару, требуется большое количество «энергии активации»: связь должна преодолеть очень высокий энергетический барьер (в нашей метафоре — холм), чтобы достичь горловины песочных часов, где начинается реакция. Обычно связь не разрушается сама по себе — ей в этом помогают находящиеся рядом молекулы воды, инициируя процесс гидролиза. Чтобы этот процесс начался, молекула воды должна весьма плотно приблизиться к пептидной связи и отдать один из своих электронов атому углерода, находящемуся в этой связи (на рис. 3.3 передача электрона обозначена пунктирной линией). Эта промежуточная стадия реакции называется переходным состоянием (отсюда теория переходного состояния). Она представляет собой неустойчивую вершину энергетического «холма», который связь должна преодолеть, чтобы разрушиться в горловине песочных часов. На рисунке видно, что электрон, полученный от молекулы воды, опустился вниз до атома кислорода, соседствующего с пептидной связью. Атом кислорода с дополнительным электроном получил отрицательный заряд. Соответственно молекула воды, отдавшая электрон, осталась в переходном состоянии с положительным зарядом.
В этом моменте ситуация усложняется. Давайте разбираться. Будем считать, что молекула воды (H2O) положительно заряжена не потому, что потеряла один электрон, а потому, что теперь в ней есть голое ядро атома водорода — его протон, обозначенный знаком «+» на рисунке. Этот протон с положительным зарядом больше не имеет строго закрепленного за ним места внутри молекулы воды и становится делокализованным в квантово-механическом смысле (об этом мы говорили выше). Несмотря на то что этот протон почти все время остается внутри своей молекулы воды (см. рис. 3.3, б, схема слева), иногда он оказывается немного дальше, ближе к атому азота (см. рис. 3.3, в, схема справа) на другом конце пептидной связи. В таком положении наш блуждающий протон способен притянуть к себе один из электронов, образующих пептидную связь, и, таким образом, разрушить ее.
Подобное происходит нечасто. Дело в том, что переходные состояния (как, например, то, которое мы изобразили на рис. 3.3, б) очень кратковременны. Они настолько неустойчивы, что разрушаются легчайшим «толчком». Например, отрицательно заряженный электрон, который отдает молекула воды, легко возвращается назад и исходные вещества принимают прежнюю форму (на рисунке это показано жирной стрелкой). Такой сценарий гораздо более вероятен, чем реакция, в результате которой разрушается пептидная связь. Обычно пептидные связи не разрушаются. Так, в нейтральных растворах (не в кислых и не в щелочных) пептидная связь белка разрушится лишь наполовину более чем за 500 лет (этот временной отрезок называют периодом полупротекания реакции).
Разумеется, все описанное выше происходит именно так в отсутствие ферментов. Теперь нам предстоит узнать, как фермент способствует ускорению процесса гидролиза. Согласно теории переходного состояния, катализаторы ускоряют химические процессы (в том числе разрушение пептидной связи), делая переходное состояние более устойчивым и тем самым повышая вероятность формирования исходных продуктов. Катализаторы действуют различными способами. Например, положительно заряженный атом металла, находящийся вблизи связи, способен нейтрализовать отрицательно заряженный атом кислорода в переходном состоянии, стабилизируя его (в этом случае атом кислорода не будет спешить расставаться с электроном, полученным от молекулы воды). Придавая переходным состояниям устойчивость, катализаторы ускоряют реакцию, выполняя функцию расширения горловины песочных часов, в которых, как мы с вами представляли, данная реакция протекает.
Теперь пришло время выяснить, способна ли теория переходного состояния в рамках предложенной аналогии с песочными часами объяснить то, как ферменты ускоряют все остальные реакции, необходимые для поддержания жизни.
Туда-сюда
Итак, фермент коллагеназа, который Мэри Швейцер использовала для разрушения коллагеновых волокон, выделенных из кости древнего тираннозавра, был обнаружен Джеромом Гроссом в организме лягушки. Как вы помните, этот фермент необходим для того, чтобы преобразовать внеклеточный матрикс головастика в тот период, когда все его ткани, клетки и биомолекулы перестраиваются и он превращается во взрослую лягушку. В организме динозавра данный фермент выполнял ту же функцию. Более того, он продолжает выполнять ее в человеке: коллагеназа расщепляет коллагеновые волокна, способствуя росту и преобразованию тканей развивающегося организма или в период восстановления после травмы. Чтобы увидеть ферментативный процесс в действии, обратимся к идее, высказанной Ричардом Фейнманом в революционной для науки лекции «Там, внизу, полно места!», с которой он выступил в Калифорнийском технологическом институте в 1959 году. Считается, что лекция Фейнмана стала интеллектуальным фундаментом сферы нанотехнологий — технического проектирования на уровне атомов и молекул. Кроме того, идеи Фейнмана вдохновили создателей фильма «Фантастическое путешествие», вышедшего на экраны в 1966 году. По сюжету картины подводная лодка с экипажем ученых и врачей уменьшается до размеров молекулы и внедряется в мозг пациента с целью обнаружить и ликвидировать тромб. Чтобы разобраться в ферментативном процессе, мы также отправимся с вами в путешествие на воображаемой наноподлодке. Цель нашего путешествия — хвост головастика.
Для начала нам необходимо найти головастика. В ближайшем пруду мы обнаружим кладку лягушачьей икры и аккуратно перенесем горсть желеобразных шариков, покрытых черными точками, в стеклянный резервуар. Через какое-то время мы заметим, что некоторые икринки подергиваются, а еще через несколько дней из них появятся крошечные головастики. Рассмотрев через увеличительное стекло их основные черты — относительно большую голову с тупой мордочкой и маленьким ртом, глазки по бокам и жабры, напоминающие перышки, расположенные перед длинным хвостовым плавником, — мы обеспечим головастиков достаточным количеством пищи (водорослями) и станем ежедневно наблюдать за ними. На протяжении нескольких недель мы не увидим никаких изменений в форме тела этих существ, зато останемся под сильным впечатлением от того, насколько быстро они увеличатся в объеме и вытянутся в длину. Приблизительно через восемь недель мы заметим, что жабры головастиков втянулись внутрь тела, а на их месте появились передние конечности. Пройдет еще недели две, и из того места, откуда растет крепкий хвостик головастика, появятся задние лапки. С этого момента мы станем чаще наблюдать за головастиками, поскольку темпы изменений, которые претерпевают растущие животные, значительно ускорятся. Жабры и жаберные карманы головастика полностью исчезают, а глаза сдвигаются выше. К списку колоссальных изменений внешнего вида головастика добавляется также резкое сокращение длины его хвоста. Как раз этого мы и ждали. Теперь пришло время погрузиться на борт нашей наноподлодки, отправиться в путешествие по стеклянному резервуару и приступить к исследованию одного из самых удивительных превращений, возможных в природе.