В пятидесятые и шестидесятые годы некоторые биологи, в том числе Эдгар Цвиллинг и Джон Сондерс, провели ряд остроумных экспериментов на куриных яйцах, чтобы разобраться в том, как формируется структура скелета. Куриные эмбрионы в то время буквально разбирали и собирали по кусочкам. Их оперировали, перемещая на другие места фрагменты разных тканей, чтобы увидеть, как это скажется на развитии эмбриона. Такой подход предполагал использование тончайших методов микрохирургии и манипуляций с кусочками тканей толщиной не больше миллиметра. Пользуясь этими методами, Цвиллинг и Сондерс выявили некоторые ключевые механизмы, лежащие в основе формирования таких разных конечностей, как птичьи крылья, ласты китов и человеческие руки.
Они открыли два небольших участка ткани, которые управляют всем развитием скелетных структур внутри конечности.
Более того, крошечная полоска ткани на самом конце зачатка по сути управляет вообще всем процессом развития конечности. Стоит удалить эту полоску, и развитие останавливается. Если удалить ее на раннем этапе, у зародыша разовьется только плечо или его часть. Если удалить немного позже, разовьется плечо и предплечье. Если удалить еще позже, конечность сформируется почти полностью, но пальцы будут короткими и деформированными.
Еще один эксперимент, впервые поставленный Мэри Гасселинг в лаборатории Джона Сондерса, открыл новое перспективное направление исследований. Возьмем небольшой участок ткани с той стороны зачатка конечности, где должна сформироваться сторона мизинца, на раннем этапе развития и пересадим этот участок на противоположную сторону зачатка, чуть пониже того места, где должен сформироваться первый палец. Дадим зародышу цыпленка развиваться дальше и сформировать крыло — и получим результат, который когда-то почти для всех оказался откровением. Крыло цыпленка развилось целиком, но у него был полностью удвоенный набор пальцев. Кроме того, что еще примечательнее, дополнительный набор пальцев был зеркальным отражением нормального набора. Очевидно, что-то внутри этого участка ткани, какое-то вещество или ген, направляло процесс формирования всех пальцев конечности. Это открытие вызвало настоящую лавину новых экспериментов, которые позволили узнать, что точно такого же эффекта можно добиться и множеством других способов. Например, можно взять куриный эмбрион и вколоть немного витамина А в зачаток его конечности или просто ввести витамин А в яйцо и дать цыпленку развиваться дальше. Если ввести витамин А в определенном количестве и на определенном этапе развития, можно получить такие же зеркально удвоенные конечности, как в опытах Гасселинг, Сондерса и Цвиллинга с пересадкой участка ткани. Этот участок назвали зоной поляризующей активности (ЗПА). По сути ЗПА и служит тем фактором, который делает сторону мизинца отличной от стороны большого пальца. Разумеется, у цыпленка нет ни настоящего мизинца, ни настоящего большого пальца, потому что пальцы в птичьих крыльях редуцированы. Мы пользуемся этими терминами условно, для обозначения тех сторон конечности, где у наделенных пятью пальцами позвоночных образуются пятый и первый пальцы соответственно.
Пересадка небольшого участка ткани, так называемой ЗПА, приводит к удвоению пальцев
Эти открытия вызвали немалый интерес: получалось, что ЗПА каким-то образом управляла образованием пальцев. Но как? Некоторые ученые считали, что клетки ЗПА производят вещество, которое затем распространяется по зачатку конечности, указывая клеткам, какие пальцы им формировать. Главная идея была в том, что в основе всего этого явления могло лежать действие какого-то неизвестного вещества. В участках, близких к ЗПА, где концентрация этого вещества высока, клетки реагируют формированием мизинца. На противоположной стороне развивающейся руки, далеко от ЗПА, это вещество разбавлено, и клетки реагируют на это формированием большого пальца. Клетки, расположенные посередине, тоже реагируют соответственно концентрации этого вещества, формируя указательный, средний и безымянный пальцы.
Идею зависимости формирования пальцев от концентрации некоторого вещества вполне можно было проверить. В 1979 году Деннис Саммербелл вживил крошечный фрагмент фольги в зачаток конечности цыпленка между участком ЗПА и остальной конечностью. Замысел был в том, чтобы предотвратить просачивание каких-либо веществ от ЗПА на другую сторону конечности. Затем Саммербелл пронаблюдал, что происходило с клетками по обе стороны от этой преграды. Клетки на стороне ЗПА формировали пальцы. Клетки на другой стороне не всегда формировали пальцы, а если формировали, то недоразвитые и деформированные. Вывод был очевиден: некое вещество, выделяемое ЗПА, действительно управляет формированием пальцев и определяет их облик. Чтобы выделить это вещество, исследователям пришлось обратиться к ДНК.
Рецепт на ДНК
Эту работу выполняло уже новое поколение ученых. До девяностых годов прошлого века, когда стали доступны новые молекулярные технологии, ученым не удавалось выяснить, какие гены управляют действием ЗПА.
Важный прорыв был сделан в 1993 году, когда охотой на эти гены занялись в лаборатории Клиффа Тейбина в Гарварде. Целью этой охоты было выяснить, какие молекулярные механизмы дают ЗПА способность делать мизинец непохожим на большой палец. К тому времени, когда группа Тейбина начала работу в начале девяностых, ряд экспериментов вроде тех, что я описал выше, привел ученых к убеждению, что в основе всего этого явления лежало какое-то вещество. Великолепная теория, если не считать того, что никто не знал, что это за вещество. Люди предлагали на эту роль то одно соединение, то другое и всякий раз убеждались, что эти вещества не оказывают искомого действия. Наконец сотрудники лаборатории Тейбина применили другой подход, имеющий непосредственное отношение к предмету нашей книги. Они решили обратиться за ответом к мухам.
Генетические эксперименты восьмидесятых годов позволили обнаружить поразительный набор генов, под действием которых сложное тело будущей мухи лепится из единственной яйцеклетки. Тело плодовой мушки дрозофилы имеет передний и задний концы. На переднем находится голова, на заднем — брюшко, посередине — крылья. Целые батареи генов включаются и выключаются по ходу развития личинки, и последовательность их включения и выключения позволяет оформляться различным частям тела будущей мухи.
Тейбин тогда еще не знал об этом, но в двух других лабораториях — Энди Макмэхона и Фила Ингама — тоже независимо друг от друга пришли к той же самой идее. Результатом этого совпадения стало очень успешное сотрудничество трех разных лабораторий. Внимание Тейбина, Макмэхона и Ингама привлек один из мушиных генов. Они заметили, что работа этого гена делает один конец сегмента тела мухи отличным от другого. Генетики, работающие с дрозофилами, назвали этот ген «hedgehog» (то есть «ежик»). Разве не напоминает работа «ежика» в ходе формирования тела мухи — делать один участок тела непохожим на другой — работу ЗПА, которая делает мизинец непохожим на большой палец? От сотрудников трех лабораторий не ускользнуло это сходство. И они взялись за дело, разыскивая ген hedgehog в клетках таких животных, как куры, мыши и рыбы.
В этих лабораториях знали, как устроен ген hedgehog у мух, и сравнивали его с генами курицы, чтобы найти похожий. Каждый ген обладает определенной последовательностью составляющих его элементов (нуклеотидов). Молекулярные методы позволили исследователям «просматривать» ДНК курицы в поисках такой же последовательности, как в гене hedgehog. После долгих проб и ошибок им наконец удалось найти куриный аналог гена hedgehog.
Точно так же, как палеонтологи дают названия новым открытым видам, генетики дают названия новым генам. Генетики, занимавшиеся мухами-дрозофилами и открывшие ген hedgehog, назвали его так потому, что у мух, у которых в этом гене была мутация, на теле были щетинки, напоминающие колючки ежа. Тейбин, Макмэхон и Ингам назвали куриный аналог этого гена «Sonic hedgehog» в честь ежика Соника — персонажа видеоигр, выпускаемых компанией Sega.
Настало время для самого интересного вопроса: что именно делает Sonic hedgehog в конечностях? В лаборатории Тейбина к молекуле, присоединяющейся к этому гену, приделали пигмент, который позволял наблюдать, в каких клетках зачатка конечности этот ген работает. К немалому удивлению исследователей, они обнаружили, что этот ген задействован лишь в небольшом участке ткани, а именно в ЗПА!
Отсюда с очевидностью следовало, что нужно делать дальше. Ген Sonic hedgehog работает точно там же, где работает сама ЗПА. Вспомним, что если обработать конечность ретиноевой кислотой (витамином А), то еще одна ЗПА вступает в действие на противоположном конце конечности. Нетрудно угадать, что будет, если обработать конечность ретиноевой кислотой и после этого посмотреть, где будет действовать Sonic hedgehog. Как и следовало ожидать, после обработки ретиноевой кислотой этот ген активен на обеих сторонах конечности — мизинца и большого пальца, — точно так же, как и ЗПА.
Настало время для самого интересного вопроса: что именно делает Sonic hedgehog в конечностях? В лаборатории Тейбина к молекуле, присоединяющейся к этому гену, приделали пигмент, который позволял наблюдать, в каких клетках зачатка конечности этот ген работает. К немалому удивлению исследователей, они обнаружили, что этот ген задействован лишь в небольшом участке ткани, а именно в ЗПА!
Отсюда с очевидностью следовало, что нужно делать дальше. Ген Sonic hedgehog работает точно там же, где работает сама ЗПА. Вспомним, что если обработать конечность ретиноевой кислотой (витамином А), то еще одна ЗПА вступает в действие на противоположном конце конечности. Нетрудно угадать, что будет, если обработать конечность ретиноевой кислотой и после этого посмотреть, где будет действовать Sonic hedgehog. Как и следовало ожидать, после обработки ретиноевой кислотой этот ген активен на обеих сторонах конечности — мизинца и большого пальца, — точно так же, как и ЗПА.
Зная строение куриного гена Sonic hedgehog, другие исследователи занялись поиском этого гена у других живых существ, наделенных пальцами, от лягушек до людей. Оказалось, что у всех позвоночных с четырьмя конечностями есть Sonic hedgehog. И у всех исследованных к настоящему времени животных этот ген активен в ткани ЗПА. Если Sonic hedgehog не включается как следует в течение восьмой недели развития, у эмбриона или формируются лишние пальцы, или большой палец и мизинец оказываются похожи. В некоторых случаях, когда этот ген поврежден, формируется рука, похожая на широкое весло, аж с двенадцатью похожими пальцами.
Сегодня известно, что Sonic hedgehog представляет собой один из десятков генов, работа которых позволяет формировать наши конечности от плеча или бедра и до кончиков пальцев за счет их последовательного включения и выключения в определенное время. Примечательно, что работы, проведенные на курицах, лягушках и мышах, дали одинаковые результаты. Записанный на ДНК рецепт формирования плеча, предплечья, запястья и пальцев по сути один и тот же у всех наземных позвоночных.
Как далеко в прошлое можем мы проследить историю гена Sonic hedgehog и других фрагментов ДНК, которые управляют развитием наших конечностей? Работают ли те же гены при формировании рыбьих плавников? Или наши руки и ноги принципиально отличаются генетически от плавников рыб? Мы нашли черты рыбы в строении наших рук и ног. Но как насчет ДНК, управляющей их развитием?
Здесь и вступил в дело Рэнди Дан со своими «русалочьими кошельками».
Дадим акуле руку
Рэнди Дан пришел в мою лабораторию с простой, но довольно изящной идеей: обработать эмбрионы скатов так же, как Клифф Тейбин обрабатывал куриные яйца. Замысел Рэнди состоял в том, чтобы провести на скатах все эксперименты, проведенные на куриных яйцах учеными, изучавшими развитие кур, от хирургических операций на тканях Сондерса и Цвиллинга до генетических экспериментов Клиффа Тейбина. Развитие зародыша ската проходит внутри яйца, покрытого своеобразной скорлупой и содержащего запас желтка. К тому же эмбрионы у скатов довольно крупные, сравнимые по размеру с эмбрионами курицы. Все эти свойства были очень кстати — они позволяли нам изучать эмбрионы скатов, пользуясь генетическими, хирургическими и другими методами, разработанными для изучения куриных эмбрионов.
Что мы могли бы узнать, сравнивая развитие плавника ската или акулы с развитием крыла или ноги цыпленка? И, что еще важнее, что могли бы мы узнать о себе самих из такого сравнения?
Конечности цыплят как показали Сондерс, Цвиллинг и Тейбин, представляют собой на удивление хорошую модель для изучения развития наших собственных конечностей. Все, что открыли Сондерс и Цвиллинг, вырезая и вживляя кусочки ткани, и все, что установили Тейбин и его коллеги в своих опытах с ДНК, с тем же успехом относится и к нашим конечностям. У нас тоже есть ЗПА, тоже есть Sonic hedgehog, и для нашего нормального развития они играют ту же ключевую роль. Как мы уже убедились, неправильно работающая ЗПА или мутация в гене Sonic hedgehog могут привести к серьезным деформациям конечностей, причем и у человека тоже.
Рэнди хотел узнать, насколько механизм формирования наших конечностей отличается от такого механизма у акул и скатов. Насколько глубока наша связь с остальными живыми существами? Новый ли рецепт обеспечивает правильное формирование наших рук, или он имеет глубокие корни в других существах? И если имеет, то насколько глубокие?
Акулы и их родственники — самые древние существа, у которых плавники имеют скелетную основу. В идеале, чтобы ответить на вопрос Рэнди, надо было бы добыть ископаемую акулу возрастом 400 миллионов лет, привезти ее в лабораторию, разрезать на кусочки и посмотреть на ее гены. Затем надо было бы поэкспериментировать с эмбрионами ископаемого, чтобы узнать, работает ли в зачатках их плавников ген Sonic hedgehog и включается ли он там же, где он включается в зачатках наших конечностей. Это был бы чудесный эксперимент, но, к сожалению, провести его невозможно. Из таких древних ископаемых уже нельзя извлечь ДНК, а если бы и можно было, все равно нам не удалось бы заполучить эмбрионы этих ископаемых, чтобы проводить на них наши опыты.
Поэтому мы обращаемся к следующему по качеству объекту — современным акулам и их родственникам. Плавник акулы никто не перепутает с человеческой рукой — сложно представить себе две более непохожих конечности. Не только сами акулы состоят с человеком в довольно далеком родстве, но и скелетная основа их плавников совсем не похожа на скелет наших конечностей. В плавниках акулы нельзя найти ничего, даже отдаленно напоминающего оуэновское «кость — две кости — много косточек — пальцы». Вместо этого внутри акульего плавника находятся кости, похожие на прутья: длинные и короткие, широкие и узкие. Мы их называем костями, но на самом деле они состоят из хрящевой ткани (акул и скатов именуют хрящевыми рыбами, потому что их скелеты никогда не затвердевают до состояния настоящих костей). Если уж мы решили выяснить, уникальны ли функции гена Sonic hedgehog для наземных позвоночных, то почему бы не посмотреть на животное, во многих отношениях совсем другое? Кроме того, почему бы не выбрать представителя самых примитивных из современных позвоночных, у которых вообще имеются парные конечности? Акулы прекрасно подойдут и для того и для другого.
Наша первая задача была довольно проста. Нам нужен был надежный источник эмбрионов акул и скатов. Оказалось довольно сложно найти способ регулярно получать яйца акул, но со скатами, их близкими родственниками, дела обстояли лучше. В итоге мы начали наши эксперименты с акул и перешли на скатов, когда запасы акул иссякли. Мы нашли поставщика, который примерно раз в пару месяцев присылал нам контейнер с двадцатью-тридцатью яйцами с эмбрионами внутри. У нас, как у туземцев-островитян, выработался настоящий карго-культ, когда мы каждый месяц с нетерпением ожидали прибытия драгоценных эмбрионов.
Результаты, полученные Тейбином и другими генетиками, помогли Рэнди правильно спланировать эксперименты. Со времени работы Тейбина 1993 года ген Sonic hedgehog был найден уже у очень многих видов позвоночных, от рыб до людей. Зная строение гена Sonic hedgehog, Рэнди мог «просмотреть» ДНК ската и акулы в поисках этого гена. Очень скоро он нашел его — акулий Sonic hedgehog.
Теперь нужно было ответить на следующие два главных вопроса. Где в эмбрионе акулы работает Sonic hedgehog? И, что еще важнее, что именно он делает?
Работая с яйцами скатов, Рэнди установил, где и когда включается Sonic hedgehog в ходе развития их эмбрионов. Вначале он выяснил, когда происходит включение этого гена — на том же этапе развития конечности, что у цыпленка, или нет. Оказалось, что на том же. Затем он выяснил, включается ли этот ген на участке ткани на заднем краю плавника, который соответствует нашей стороне мизинца. И снова оказалось, что именно там. Затем он провел эксперименты с витамином А. Это был самый захватывающий этап. Если обработать зачаток конечности цыпленка или млекопитающего этим соединением, то на стороне большого пальца появится еще один участок, на котором работает ген Sonic hedgehog, и это приведет к удвоению костей конечности. Рэнди ввел витамин А в эмбрионы, подождал около суток и затем проверил, вызывает ли витамин А у зародышей скатов, как и у зародышей курицы, включение гена Sonic hedgehog на противоположной стороне конечности. Оказалось, что вызывает. Теперь нам предстояло долго ждать. Мы уже узнали, что Sonic hedgehog в зачатках плавников акул и скатов вел себя так же, как в зачатках наших рук и куриных крыльев. Но какое действие окажет все это на формирование скелета? Ответа пришлось ждать два месяца.