Теперь Бидл и Тейтем занялись производством мутантов хлебной плесени. Некоторые из них теряли способность синтезировать определенные аминокислоты, потому что лишались ключевого фермента. Но если Бидл и Тейтем затем скрещивали мутантную плесень с обычной, то некоторые потомки такого союза вновь обретали эту способность. В 1941 г. ученые сделали вывод: за каждым ферментом хлебной плесени стоит один ген.
Вырисовывалась смутная, но непротиворечивая картина того, как работают гены — по крайней мере гены животных, растений и грибов. Но бактериям в этой картине, казалось, места не было. Становилось все очевиднее, что гены находятся в хромосомах, а у бактерий хромосомы, на первый взгляд, вообще отсутствовали. Если у них и есть гены, то в те времена ученые почти не надеялись их найти. Гены дрозофилы удавалось изучать благодаря тому, что мушки размножаются половым путем. В ходе этого процесса хромосомы обмениваются участками, и гены попадают к потомкам в разных сочетаниях. На бактериях, однако, ученые не могли проводить подобных экспериментов, потому что они не имеют пола. На первый взгляд бактерия просто растет, а затем делится пополам. Многие исследователи рассматривали бактерии просто как мягкие мешочки с ферментами — принципиально иной тип жизни.
Со временем выяснилось, однако, что вся жизнь на Земле, включая и бактериальную, основана на одних и тех же фундаментальных принципах. Раскрыть ученым многие тайны этого единства было суждено бактерии E. coli, которая стала для биологов одним из самых мощных инструментов исследования жизни.
Превращение обычной бактерии в инструмент науки началось с простого вопроса. Эдвард Тейтем заинтересовался, применимо ли к бактериям открытое им в экспериментах с плесенью правило «один ген — один фермент». Он решил провести такой же опыт, как с хлебной плесенью, но на этот раз облучить не плесень, а бактерии. Для эксперимента Тейтем выбрал штамм E. coli с обозначением К-12. Он был выделен в 1922 г. из организма больного дифтерией в штате Калифорния, и с тех пор культура этого штамма поддерживается в Стэнфордском университете для занятий по микробиологии.
Выбор Тейтема был обусловлен практическими соображениями. Подобно большинству других штаммов E. coli, К-12 безвреден. Кроме того, E. coli способна самостоятельно производить все необходимые ей аминокислоты и множество других молекул. Для питания ей почти ничего не нужно, кроме сахара, аммиака и некоторых микроэлементов. Если E. coli использует многочисленные ферменты, чтобы превращать пищу в живую материю, то мишеней для рентгеновского облучения у Тейтема должно было оказаться достаточно. Даже если бы облучение привело к появлению всего нескольких мутантных бактерий нужного типа, благодаря «роскошному росту», которым знаменита E. coli, ученый смог бы их увидеть. Ведь одна — единственная бактериальная клетка E. coli способна очень быстро, всего за сутки, дать колонию, видимую невооруженным глазом.
Итак, Тейтем обрабатывал колонии E. coli мощным рентгеновским излучением, способным убить 9999 из каждых 10000 бактерий. Среди немногочисленных выживших он отыскивал мутантов, способных расти, только если их обеспечивали какой‑то определенной аминокислотой. С такой поддержкой мутанты могли даже размножаться, но их потомство наследовало тот же дефект. По существу, Тейтем получил такой же результат, что и в опытах с хлебной плесенью. Было похоже, что за каждым ферментом E. coli тоже скрывается один- единственный ген.
Это было серьезное открытие, но Эдвард Тейтем подходил к оценке его значения с осторожностью. Да, получалось, что у бактерии тоже есть гены, но наверняка он этого утверждать не мог. Лучший способ доказать наличие у биологического вида генов — скрестить мужские и женские особи и изучить их потомство. Но E. coli, как ни печально, беспола и в брак не вступает. «Поэтому понятие “ген” можно использовать по отношению к бактериям лишь в самом общем смысле», — писал Тейтем.
Положение несколько изменилось, когда в лаборатории Тейтема в Йельском университете появился мрачный молодой студент. Джошуа Ледербергу было всего 20 лет, но амбиции у него были серьезные: выяснить, есть ли у бактерий половое размножение. Во время службы в армии в годы Второй мировой войны Ледербергу довелось работать в военно — морском госпитале на Лонг — Айленде. В частности, он занимался исследованиями малярийного паразита, завезенного в Америку моряками, воевавшими в Тихом океане. Он наблюдал за этими простейшими и видел, что те иногда размножаются делением, а иногда образуют женские и мужские формы и вступают в половой процесс. Что если у бактерий тоже время от времени происходит половой акт, просто никто этого до сих пор не замечал? И пускай другие высмеивают его идею как необоснованную фантазию, Ледерберг твердо решил, что игра стоит свеч, и, как он сам говорил позже, «сделал ставку на бактериальный секс».
Услышав про эксперименты Тейтема, Ледерберг понял, что их вполне можно приспособить к поиску полового размножения у бактерий. У Тейтема к тому времени уже собралась хорошая коллекция мутантных форм E. coli штамма К-12, в том числе и двойных мутантов — бактерий, которым для выживания требовалась постоянная подкормка двумя химическими соединениями. Ледерберг рассудил, что если смешать две разновидности двойных мутантов, то они, возможно, сумеют через половой акт передать друг другу работающие версии поврежденных генов.
Две E. coli занимаются «бактериальным сексом»
Ледерберг выбрал для эксперимента мутантный штамм, не способный самостоятельно производить аминокислоту метионин и один из витаминов группы В — биотин. Второй выбранный им штамм не мог производить две другие аминокислоты — треонин и пролин. Ледерберг поместил оба штамма в бульон, насыщенный всеми четырьмя необходимыми веществами, так чтобы мутантные бактерии могли расти и размножаться. В течение нескольких недель они жили вместе в бульоне, где у них были все условия для гипотетического «секса».
Через некоторое время Ледерберг взял пробы получившейся бактериальной культуры и перенес их в свежие чашки Петри.
Теперь он поместил бактерии в среду, где отсутствовали все четыре питательных вещества, которые те не умели синтезировать самостоятельно: треонин, пролин, метионин и биотин. Ни один из исходных мутантных штаммов не смог бы выжить в такой среде. И если бы их потомки были всего лишь копиями предков, размышлял Ледерберг, они тоже должны были прекратить рост и погибнуть.
Несколько первых недель принесли ученому лишь разочарования — погибшие пробы, мертвые колонии, но в конце концов Ледерберг получил в одной из чашек живую и процветающую колонию E. coli. Какая‑то часть бактерий обрела способность производить все четыре аминокислоты. Ледерберг сделал вывод о том, что их предки должны были обменяться генами в ходе некоего процесса, сходного с половым актом[1]. Кроме того, в ходе этого процесса они доказали, что обладают генами.
В последующие годы открытие Ледерберга позволило ученым разводить E. coli как плодовых мушек; в результате им удалось изучить ее гены намного подробнее, чем раньше. Двенадцать лет спустя, в «преклонном» возрасте 33 лет, Ледерберг (совместно с Тейтемом и Бидлом) получил Нобелевскую премию по медицине. Но в 1946 г., увидев в чашке Петри вожделенные точки колоний, развившихся из бактерий, которые появились в результате полового размножения, Ледерберг позволил себе пометить результаты опыта в своей записной книжке одним — единственным словом: «Ура!»
Паразит и его хозяин
Пока Ледерберг наблюдал, как E. coli занимается «сексом», другие ученые наблюдали, как эта бактерия болеет, и узнавали при этом не менее важные вещи о природе жизни.
Первым оценил, насколько информативна может быть больная E. coli, не биолог, а физик. Макс Дельбрюк первоначально учился у Нильса Бора и других пионеров квантовой физики. В 1930–е гг. казалось, что при помощи нескольких красивых уравнений можно разрешить многие великие загадки Вселенной. Но природа не собиралась уступать. Физиков поражало, что гены, необходимые для создания любого живого существа, будь то кенгуру или, скажем, мох печёночник, упакованы в одну — единственную клетку. Дельбрюк решил сделать темой своих исследований жизнь, или, говоря конкретнее, гены живых существ.
Ген, предположил Дельбрюк, представляет собой полимер, образованный с помощью многократного повторения одних и тех же атомных структур. Чтобы раскрыть законы, которым подчиняется этот полимер, Дельбрюк приехал в США и поступил в лабораторию Моргана, где работали с мушками. Однако, будучи физиком, он отверг весь тот клубок сложностей, к которому приводил выбор дрозофилы в качестве объекта исследования. Ему требовалась другая, более простая система, изучение которой могло бы дать гораздо больше информации. По счастливому совпадению Эмори Эллис, еще один сотрудник лаборатории Моргана, занимался изучением вирусов, инфицирующих E. coli.
Ген, предположил Дельбрюк, представляет собой полимер, образованный с помощью многократного повторения одних и тех же атомных структур. Чтобы раскрыть законы, которым подчиняется этот полимер, Дельбрюк приехал в США и поступил в лабораторию Моргана, где работали с мушками. Однако, будучи физиком, он отверг весь тот клубок сложностей, к которому приводил выбор дрозофилы в качестве объекта исследования. Ему требовалась другая, более простая система, изучение которой могло бы дать гораздо больше информации. По счастливому совпадению Эмори Эллис, еще один сотрудник лаборатории Моргана, занимался изучением вирусов, инфицирующих E. coli.
Вирусы, способные заразить E. coli, были слишком малы; Дельбрюк и Эллис не могли их видеть. Насколько тогда было известно, эти вирусы проникают в своих хозяев — бактерий и размножаются внутри них; затем убивают микроорганизм и выходят наружу в поисках новых жертв. Казалось, что вирусы — потомки в точности похожи на предков, и это позволяло предположить, что они тоже могут обладать генами. Дельбрюк и Эллис решили выяснить историю болезни E. coli, вызываемой вирусами- бактериофагами.
При изучении бактериофагов ученые могли опираться только на косвенные свидетельства. Стоило добавить вирусы в чашку с E. coli, как они проникали внутрь бактерий и начинали там размножаться. Новые бактериофаги выходили наружу, оставляя за собой бренные останки хозяина, и заражали другие бактерии. Через несколько часов культура бактерий в чашке оказывалась испещрена прозрачными лужицами — следами безжалостного побоища. «О присутствии бактериальных вирусов можно судить по погубленным бактериям, — говорил Дельбрюк, — так же как по исчезновению куска торта можно судить о присутствии маленького мальчика».
Ученые располагали лишь косвенными признаками присутствия бактериофагов, зато признаков этих было много. Целая чашка могла заполниться миллиардами новых вирусов всего за несколько часов. Необъятные возможности разработанной Дельбрюком и Эллисом методики привлекли к ним небольшую стайку молодых ученых. Они называли себя приверженцами «Церкви фагов», с папой Дельбрюком во главе. Эту молодые люди сумели наглядно продемонстрировать, что бактериофаги, инфицирующие E. coli, не все одинаковы. Некоторые вирусы паразитировали лишь на определенных штаммах бактерии, другие штаммы им не давались. Вызывая у вирусов мутации, исследователям удавалось добиться, что эти вирусы начинали заражать новые штаммы, причем способность поражать E. coli передавалась по наследству. Стало ясно, что у вирусов тоже есть гены, причем гены, которые, по идее, должны быть очень похожи на гены хозяина, то есть E. coli.
На самом деле гены хозяина и паразита настолько похожи, что некоторые разновидности вирусов способны как бы встроиться в хромосомы E. coli и замаскироваться. Эти, как их назвали, умеренные бактериофаги могли проникнуть в клетки E. coli и, по существу, исчезнуть[2]. Носители бактериофага вели себя нормально, росли и делились точно так же, как их не зараженные вирусом собратья. Тем не менее ученые обнаружили, что бактериофаги умудрялись уцелеть внутри E. coli, которая исправно передавала их геном следующим поколениям бактерий. Чтобы «оживить» бактериофаг, ученым достаточно было облучить чашку с зараженной E. coli ультрафиолетом. Бактерии тут же лопались, выпуская на волю сотни новых вирусов, которые пускались на поиски новых хозяев, оставляя за собой прозрачные лужицы разрушения. В общем, двое сливались воедино, чтобы при случае вновь разделиться надвое.
Из чего сделаны гены?
В танце — слиянии E. coli и ее вирусов приверженцы «Церкви фагов» сумели отыскать ключи к некоторым великим загадкам жизни. А для них не было вопроса более великого, как вопрос о том, из чего сделаны гены.
До 1950–х гг. большинство ученых склонялось к мысли, что гены состоят из белков. Прямых доказательств получить не удавалось, но серьезных косвенных свидетельств было немало. Уже тогда становилось ясно, что гены есть у всех живых организмов, даже у бактерий и вирусов. Белки не менее вездесущи. При изучении плодовых мушек ученые определили, что их гены располагаются в хромосомах; а хромосомы содержат белки. Было ясно, что молекулы в генах должны быть сложными — ведь в генах каким‑то неведомым образом зашифрована информация о жизни во всех ее проявлениях. При этом ученые знали, что структура белка часто бывает весьма замысловатой. Оставалось только выяснить, как именно белки исполняют функции генов.
Первый серьезный вызов этой общей, хотя и не слишком определенной, позиции появился в 1944 г., когда один врач во всеуслышание заявил, что гены на самом деле состоят не из белка. Освальд Эйвери, работавший в больнице Института Рокфеллера, занимался исследованием бактерии Pneumococcus. У этой бактерии существует как безвредная форма, так и болезнетворная, вызывающая пневмонию. Более ранние эксперименты дали основания считать, что именно гены отвечают за различное поведение этих штаммов. Если ученые убивали опасный штамм, а затем вводили убитые бактерии мышам, то мыши не заболевали. Но если убитые бактерии опасного штамма смешивали с живыми бактериями безвредного штамма Pneumococcus, то инъекция такой смеси убивала мышей. Безвредный штамм каким‑то образом превращался в болезнетворный, и их потомки также сохраняли патогенность. Иными словами, генетический материал переходил из умерщвленных бактерий патогенного штамма к живым бактериям.
Эйвери и его коллеги стали выделять из убитых бактерий одно химическое соединение за другим и добавлять их в чашки с непатогенными штаммами бактерий. Они обнаружили, что интересующее их превращение обеспечивает только одно вещество. И это был не белок, а соединение под названием дезоксирибонуклеиновая кислота, или сокращенно ДНК.
О существовании ДНК ученые знали уже несколько десятилетий, но не представляли себе, зачем она нужна. В 1869 г. швейцарский биохимик Иоганн Мишер обнаружил в гное на повязках раненых солдат богатое фосфором вещество, которое получило название нуклеиновой кислоты. Позже ученые выяснили, что существует две почти идентичные нуклеиновые кислоты: дезоксирибонуклеиновая и рибонуклеиновая (РНК)[3]. Каркас ДНК состоит из остатков фосфорной кислоты, соединенных с остатками сахара дезоксирибозы. К нему прикрепляются четыре типа богатых углеродом и азотом соединений — так называемые азотистые основания.
Было ясно, что ДНК играет в живом организме важную роль — ведь ученые находили ее практически в любых клетках. Ее обнаруживали даже в хромосомах, где, как уже было известно, располагались гены. Но многие исследователи считали, что ДНК просто обеспечивает хромосоме жесткую основу, каркас — возможно, она обвивается вокруг генов, как манжета. Мало кто думал, что ДНК имеет достаточно сложную структуру, чтобы быть материальным носителем генов. ДНК, как выразился однажды Дельбрюк, «такое глупое вещество!»
Глупое или нет, но Эйвери сделал вывод: ДНК — именно то, из чего состоят гены. Но его эксперименты не смогли убедить закоренелых скептиков:
Вирус вводит свою ДНК в клетку E. coli
коллеги решили, что ДНК у него была недостаточно хорошо очищена и, возможно, содержала примеси каких‑то белков.
Чтобы восстановить репутацию ДНК, потребовалось еще целое десятилетие исследований на E. coli и ее вирусах. Пока Эйвери исследовал пневмококк в поисках генов, адепты дельбрюковой «Церкви фагов» пытались увидеть вирусы E. coli. Надо сказать, что вирусы в представлении ученых были уже не математическими абстракциями, а вполне материальными маленькими существами. При помощи недавно изобретенного прибора — электронного микроскопа — Дельбрюк и его коллеги обнаружили, что бактериофаги заключены в оболочку элегантной геометрической формы. Закрепившись на поверхности E. coli, фаг прокалывал клеточную стенку бактерии с помощью специальной белковой иголки и вводил в своего нового хозяина некую субстанцию. Гены вируса проникали в клетку E. coli, а пустая оболочка оставалась на ее поверхности.
Жизненный цикл вирусов, инфицирующих E. coli, дал ученым возможность провести простой и красивый эксперимент. Альфред Херши и Марта Чейз, исследователи из частной лаборатории в Колд — Спринг — Харбор в штате Нью — Йорк, пометили радиоактивными изотопами ДНК бактериофагов. Позволив этим вирусам внедриться в клетки E. coli, они затем с помощью высокоскоростного центрифугирования удалили с бактерий их пустые оболочки. Теперь радиоактивное излучение регистрировалось в бактериях, а не в покинутых оболочках.