Однако Дюбо и Эвери постоянно сталкивались с препятствиями в работе. Частично это объясняется тем, что многое в новаторской области исследований было им неизвестно. Более личной и серьезной проблемой был развившийся у Эвери из-за стресса тиреотоксикоз – подрывающее силы аутоиммунное заболевание, вызванное избыточной активностью щитовидной железы.
При тиреотоксикозе организм буквально затопляют тиреодные гормоны, и метаболизм начинает работать на износ, вызывая опасное переутомление. Эвери постоянно чувствовал дрожь, возбуждение, физическое и душевное беспокойство, он не мог расслабиться и страдал от нарушений сна. Для творческого человека находиться в таком состоянии невозможно. Ему пришлось на некоторое время уйти из лаборатории и лечь в больницу для удаления «токсичного зоба». Нужно сказать, что такая операция имеет высокий риск побочных эффектов и в некоторых случаях может привести к смерти пациента. Хирург рекомендовал Эвери в первое время после процедуры избегать любых физических и умственных нагрузок. Дюбо вспоминает, что Эвери не возвращался в лабораторию в течение полугода, а без него работа медленно угасала. Дюбо писал: «Я занимался [своим исследованием] три или четыре года, но не смог продвинуться в нем достаточно далеко, потому что и в моих знаниях в области генетики и биохимии, и в состоянии самих этих наук имелись серьезные пробелы».
Однако, несмотря на трудности, Дюбо продолжал работу, и в 1939 году его старания были вознаграждены – ученому удалось открыть первый антибиотик на основе почвенных микроорганизмов, названный грамидицином. Однако грамидицин нельзя было принимать перорально или вводить в виде инъекции из-за его высокой токсичности. Единственной областью его применения были заболевания кожи. Дюбо продолжил исследования, а затем совершенно внезапно пальму первенства в этой области перехватил конкурент Дюбо и Эвери. Доктор Герхард Домагк, работавший в лаборатории компании Bayer в Эльберфельде, заявил об открытии нового антибактериального агента – пронтозил. Этот первый из так называемых сульфаниламидных препаратов был немедленно включен в арсенал медиков и стал применяться в лечении ряда инфекционных заболеваний, ранее считавшихся смертельными.
Сегодня мы часто забываем, что еще в 1930-х годах человечество практически не контролировало инфекционные заболевания. Эпидемии скарлатины, кори, пневмонии, менингита и полиомиелита волнами прокатывались по планете с постоянной частотой (иногда ежегодно). Другие опасные болезни угрожали людям ежедневно: туберкулез, который косил больных целыми семьями, септический артрит, септический остеомиелит, вызывающий болезненные абсцессы в костях, и распространенная, но смертельно опасная стрептококковая инфекция, которая могла распространиться из воспаленного горла в мозг, вызывая абсцесс. В большинстве стран, как развитых, так и развивающихся, инфекции (включая бессимптомные формы туберкулеза) убивали в первую очередь людей с ослабленным иммунитетом. Лечение инфекционных заболеваний было важнейшей задачей, стоящей перед человечеством. Для Дюбо и в первую очередь для Эвери падение их линии обороны было настоящей трагедией.
Когда по прошествии установленного врачами срока Эвери вернулся к работе, он переключился на изучение трансформирующего вещества. Колин Маклеод усовершенствовал технологию его выделения, и теперь лаборатория могла получать достаточное количество вещества для анализа и тестирования. Прогресс не заставил себя ждать, и в отчете для правления Рокфеллеровского института за 1940–1941 годы Эвери и Маклеод уверенно утверждали, что даже после самой тщательной очистки в трансформирующем веществе не было обнаружено белка.
Летом того же года Маклеод покинул институт. Он получил пост профессора бактериологии медицинского факультета Нью-Йоркского университета. Тем не менее он продолжал интересоваться проектом, часто приезжал в Институт и давал свои рекомендации. Место Маклеода в эксперименте с трансформирующим агентом занял молодой педиатр Маклин Маккарти, который привнес в лабораторию недостающие знания в области биохимии. Теперь, когда команда Эвери располагала достаточным количеством трансформирующего вещества в стабильной форме, Маккарти мог применить свои химические навыки для его дальнейшей обработки и выявления активного ингредиента. Он начал с культур пневмококков в больших объемах (от 50 до 75 литров) и разработал последовательность действий для увеличения объема производимого трансформирующего вещества с параллельным удалением протеинов, полисахаридов и рибонуклеиновой кислоты. В соответствии с распространенным подходом к принципу наследования считалось, что ключом к нему являются нуклеопротеины. Таким образом приоритетом работ Маккарти стало обеспечение отсутствия белков в конечном тестовом материале.
К этому моменту Маккарти удалось получить концентрированный раствор активного материала. Он добавил в него ряд энзимов, таких как кишечный трипсин и химотрипсин, разрушающих белки, рибонуклеиновую кислоту и полисахариды в оболочках пневмококков. Оставшееся вещество еще раз обработал хлороформом в попытке уничтожить даже остаточные протеиновые следы.
К концу 1942 года, после многочисленных экспериментов Маккарти пришел к выводу, что трансформирующие свойства заключались в крайне вязкой фракции, состоявшей почти исключительно из полимеризированной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Поместив эту фракцию в колбу, он начал выделять осадок, добавляя к ней по капле абсолютный этиловый спирт (практически не содержащий воды) и помешивая раствор стеклянной палочкой. Активный материал выделился в растворе в форме длинных и очень тонких белых нитей, закручивающихся вокруг палочки. Дюбо вспоминает, какой восторг испытали сотрудники лаборатории, наблюдавшие за появлением этих нитей – трансформирующего вещества в чистой форме.
В начале 1943 года Эвери, Маклеод и Маккарти представили результаты своих исследований выдающимся химикам Принстонского отделения Рокфеллеровского института медицинских исследований. Вероятно, химики были поражены или даже ошеломлены увиденным, однако они не привели никаких контраргументов и не потребовали дополнительных доказательств. В апреле того же года исследователи сообщили об открытии правлению Рокфеллеровского института, а в ноябре – всему миру в статье, отправленной в Journal of Experimental Medicine и опубликованной в начале 1944 года. Заголовок статьи был длинным и взвешенным: «Исследование химической природы вещества, индуцирующего трансформацию типов пневмококков. Индуцирование трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка типа III».
По словам Дюбо, эта публикация «имела ошеломляющий эффект». Восторг, скрываемый за осторожностью, сквозит в письме Эвери к брату Рою от 26 мая 1943 года:
«…Последние два года, сначала совместно с Маклеодом, а теперь с доктором Маккарти, я пытался выяснить химическую природу содержащегося в бактериальных экстрактах вещества, которое запускает специфические изменения… Это была та еще работа, полная тревог и неудач. Но, кажется, у нас наконец-то получилось… Если говорить вкратце, это вещество… почти полностью соответствует теоретическим свойствам чистой дезоксирибозовой нуклеиновой кислоты. Кто бы мог подумать?»
В письме Эвери называет это вещество дезоксирибозовой нуклеиновой кислотой, в публикации – дезоксирибонуклеиновой кислотой. Сегодня мы привыкли обозначать его аббревиатурой – ДНК.
2. ДНК оказывается кодом
Вспоминая о том, как поначалу он оказался не в состоянии оценить открытие Эвери, Стент пришел к выводу: «В некоторых аспектах работа Эвери и его коллег еще сильнее опередила свое время, чем труды Менделя».
По мнению лауреата Нобелевской премии Лайнуса Полинга, ученым повезло, ведь в их мире гораздо больше тайн и загадок, чем в мире людей, не интересующихся наукой. И действительно, в то время в лаборатории Эвери при Рокфеллеровском институте медицинских исследований царило ощущение восторга и предвкушения. В 1943 году Освальду Эвери исполнилось 65 лет. Ранее он планировал выйти на пенсию и переехать в Нэшвилл к семье своего брата Роя, но теперь вопрос об уходе из лаборатории даже не стоял. Необходимо было продолжить работу над трансформирующим началом. В частности, Эвери нужно было убедить коллег-микробиологов, а затем и все скептически настроенное биохимическое и генетическое сообщество в важности своего открытия.
Эвери по натуре был консерватором. За десятилетие с небольшим до этого он вместе с коллегой выдвинул предположение, что иммунологические различия между различными типами пневмококков определяются сложными молекулами сахаров (полисахаридами), а не белками. Эта теория в конечном итоге оказалась верной, но изначально вызвала резкую полемику, которая не могла не сказаться на нервном и чувствительном Эвери. В длинном и бессвязном письме брату Эвери несколько раз упоминает о том, как его беспокоит реакция общественности на открытие: «Опасно выходить на публику неподготовленным… Надувать мыльные пузыри очень весело, но лучше лопать их самому, прежде чем это попытается сделать кто-то еще».
Один из соперников поджидал Эвери совсем рядом. Альфред Э. Мирски, выдающийся биохимик и генетик, также работавший в Рокфеллеровском институте, отнесся к открытию Эвери с недоверием. К тому же Мирски считался специалистом по ДНК. Именно он открыл так называемый принцип константности ДНК, предполагающий, что количество ДНК в ядре каждой клетки остается неизменным. И вот теперь он сомневался в эффективности способа, который Маккарти применил для выделения ДНК. Приверженец «чистых» биохимических экспериментов, Мирски верил, что за наследственность отвечают белки ядра – так называемые нуклеопротеины. Даже в 1946 году он продолжал утверждать, что двух энзимов, использованных Маккарти в опыте, было недостаточно для удаления всех белков. Мирски обладал большим влиянием в генетических кругах, и его аргументы впечатлили даже величайшего генетика того времени Германа Дж. Мёллера, получившего в том же году Нобелевскую премию за сделанное двумя десятилетиями ранее открытие мутаций в генах плодовых мушек под воздействием рентгеновских лучей. Мёллер говорил: «Так называемая нуклеиновая кислота Эвери, скорее всего, представляет собой нуклеопротеин, просто слишком сильно связанный, чтобы его можно было обнаружить обычными методами».
В какой-то степени подобное расхождение во мнениях типично для любой науки, в которой две группы ученых с разными научными базами пытаются исследовать одно и то же явление. Если новое открытие противоречит общепринятой парадигме, аргументы неизбежно становятся все более желчными. Но громкие протесты Мирски сказались на нем особенно негативно. В 1947 году Мёллер в качестве научной работы опубликовал «Пилгримовскую лекцию». В ней он заявлял, что вопрос о том, что является ключом к наследственности – нуклеиновая кислота или белок, – «остается открытым». Как писал историк и философ науки Роберт Олби, «через популярную Пилгримовскую лекцию Мёллера этот [скептический] взгляд распространился среди широкой публики».
Эвери попытался ответить критикам новой серией экспериментов со строгой проверкой качества. Маккарти покинул лабораторию в 1946 году, оставив свой эксперимент в руках педантичного Роллина Хотчкисса. Последний провел несколько новых химических опытов с экстрактом, чтобы подтвердить, что тот состоит из ДНК, и опроверг возражения Мирски, очистив экстракт до такой степени, что содержание белка в нем не превышало 0,02 %. Кроме того, Хотчкисс доказал, что белок был деактивирован недавно открытым кристаллическим энзимом, характерным для ДНК, – дезоксирибонулеазой. Многие генетики по-прежнему были непреклонны, но некоторые начали обращать внимание на работу Эвери и его лаборатории.
Впоследствии из интервью с немецким биофизиком и будущим нобелевским лауреатом Максом Дельбрюком Хорас Фриленд Джадсон узнал, что некоторые выдающиеся исследователи понимали потенциальную важность открытий Эвери. «Разумеется, присутствовал и скептицизм, – вспоминает Дельбрюк. – Любой, кто узнавал об этом, сразу же замечал парадокс… ДНК считалась бессмысленным веществом… не имеющим конкретных свойств. Кто-то явно был не прав. Либо в ДНК был смысл, либо трансформация не зависела от ДНК». Эвери задал вопрос монументальной важности, и единственным способом разрешить эту дилемму было провести альтернативный эксперимент, чтобы понять, прав он или нет.
В 1951 году такой эксперимент провели два американских микробиолога – Алфред Херши и Марта Чейз, занимавшиеся изучением того, как вирусы используют бактерии в качестве «заводов» для сборки вирусов следующего поколения. Такие вирусы называются бактериофагами, или, для краткости, фагами (от греч. phago – есть, так как вирусы поглощают культуры бактерий-носителей). Наличие и количество вирусов можно измерить, посеяв бактерии-носители в размягченный под действием тепла агар, добавив вирусы в различные растворы, а затем распределив по планшету. Остывая, агар сформирует тонкий и ровный слой слизи, который наутро будет кишеть размножающимися бактериями. В местах, где среди бактерий оказался вирус, можно будет увидеть круглое прозрачное окно, образовавшееся в результате лизиса (разрушения) бактерий. Такие окна легко увидеть и подсчитать. Этой технологии я научился еще в студенчестве от своего профессора, а впоследствии, став врачом, использовал ее в экспериментах, направленных на изучение природы аутоиммунности. Она проста и поэтому используется тысячами ученых в самых разных опытах.
Херши и Чейз заинтересовало, что вирусы-фаги формируют ядро генетического материала, заключенное в белковую капсулу. По сути, каждый вирус представляет собой нечто вроде шприца. При инфицировании он впрыскивает в бактерию-носитель генетический материал, а пустая белковая оболочка остается прикрепленной к внешней стенке клетки. Введенный в клетку генетический материал вируса копируется в процессе размножения бактерии.
Херши и Чейз разработали уникальный эксперимент, призванный показать, какое вещество лежит в основе репродуктивной системы вирусов – белок или ДНК. Для начала они добавили радиоактивный фосфор и радиоактивную серу в среды, где выращивались две отдельные колонии бактерий. Через четыре часа после того, как радиоактивные элементы были поглощены бактериями, Херши и Чейз ввели вирусы-фаги.
Для того чтобы понять суть эксперимента, нужно знать, что ДНК имеет в своем составе фосфор, но не содержит серу, в то время как аминокислоты, составляющие белки, наоборот, являются серо-, а не фосфоросодержащими.
Введя фаги в обе культуры бактерий, Херши и Чейз получили два поколения вирусов. У одного в составе имелся радиоактивный фосфор, а у другого – радиоактивная сера. Заражая бактерии, вирусы оставляли пустые белковые оболочки прикрепленными к внешним стенкам бактериальных клеток, а содержимое оболочек, в составе которого имелась и ДНК, впрыскивали внутрь. Путем центрифугирования Херши и Чейз удалили пустые оболочки. Инфицированные бактерии развивались в соответствии со своим обычным репродуктивным циклом, внутри них генерировались новые фаги, которые затем прорывали оболочки тел бактерий и попадали в питательную среду. Удалив остатки бактерий-носителей, ученые сфокусировались на сформировавшихся вирусах.
Сравнив пустые белковые оболочки вирусов с живыми, полностью сформировавшимися фагами, полными генетического материала, исследователи обнаружили, что 90 % всей радиоактивной серы остались в оболочках после инфицирования бактерий, а 85 % фосфора вошли в состав ДНК, которая попала в бактериальные клетки и сыграла роль кода для создания следующего поколения вирусов. Это подтвердило открытие Эвери: кодом к наследственности является не белок, а ДНК.
Следует заметить, что отделение оболочки вируса от ее содержимого, включающего в себя ДНК, связано с гораздо более высоким риском белковых примесей, чем процедура экстракции, которую применял Эвери. Тем не менее этот эксперимент гораздо эффективнее убедил скептически настроенных генетиков, чем опыты Эвери. Возможно, все дело было в его яркой наглядности, а может, в новом необычном способе получения информации. Помогло и то, что эксперимент признали многие выдающиеся генетики.
* * *Сегодня, оглядываясь назад, большинство ученых видят работу Эвери, Маклеода и Маккарти 1944 года как первое заявление о том, что ДНК является молекулой наследования. Его приводят в качестве одного из самых печальных примеров открытия, которое стоило Нобелевской премии, но не получило ее. Существуют многочисленные свидетельства, что старшие коллеги выдвигали Эвери в качестве кандидата, в частности, в его собственной дисциплине – микробиологии и иммунологии. Он был номинирован на Нобелевскую премию дважды: первый раз в конце 1930-х годов за работу над типами пневмококков и их связью с классификацией бактерий в целом, второй – после публикации его труда 1944 года за фундаментальный вклад в биологию. Но, судя по всему, Нобелевский комитет это не убедило. Сейчас это видится огромной ошибкой и заставляет многих людей с удивлением чесать в затылке.