История ДНК в науке начинается так. После окончания учебы в университете в 1877 г. немецкий биохимик Альбрехт Коссель стал научным сотрудником у своего бывшего преподавателя, Феликса Гоппе-Зейлера, в Страсбургском университете. В то время Гоппе-Зейлер проявлял большой интерес к веществу, которое впервые выделил в 1869 г. еще один его бывший ученик, швейцарец Фридрих Мишер, в Тюбингенском университете. Мишер исследовал лейкоциты из гноя с бинтов, которые брал в хирургической клинике. Он разработал метод выделения ядер из клеток, а из них получил вещество, которое назвал нуклеином (ядро по-гречески – “нуклеус”). Эта странная субстанция была не похожа ни на какие до сих пор известные органические вещества. Она была настолько странной, что Гоппе-Зейлер проверил результаты младшего коллеги, и только после этого, в 1871 г., статья “О химическом составе клеток гноя”[3] была опубликована. Новое вещество содержало много фосфора и обладало свойствами кислоты – как выяснилось, в его составе были фосфатные группы, от той самой фосфорной кислоты H3PO4, которую все знают со школьных уроков химии. В белках фосфора практически нет, значит, “нуклеин” – не белок. Возникла даже идея, что это вещество играет роль запаса фосфора, который может понадобиться клетке. (А вот Аристотель писал про мозг, что этот очевидно бесполезный холодный и влажный орган служит для охлаждения крови. Нам легко смеяться над заблуждениями предков.)
Честь открытия ДНК принадлежит Мишеру, но проанализировал “нуклеин” Альбрехт Коссель, лауреат Нобелевской премии по физиологии или медицине 1910 г. Он показал, что нуклеин на самом деле состоит из двух компонентов, белкового и небелкового, и назвал второй из них нуклеиновой кислотой. С 1885 по 1901 г. он со своими студентами исследовал состав этого вещества, выделяя его из различных источников. Коссель открыл азотистые основания в ДНК: – аденин – А, тимин – Т, гуанин – G и цитозин – С (а также урацил – U, который содержится вместо Т в РНК). А вот то, что нуклеиновые кислоты содержат пятиуглеродный сахар – или рибозу, или дезоксирибозу, – установил еще один человек, Феб (Фибус) Левен в Рокфеллеровском институте. Он же предложил понятие нуклеотида как элементарной единицы нуклеиновой кислоты – азотистое основание плюс рибоза либо дезоксирибоза плюс остаток фосфорной кислоты.
Открытие дезоксирибозы в составе нового вещества добавило к его названию еще пять слогов: ДезоксирибоНуклеиновая Кислота – ДНК (англ. DNA, франц. ADN, нем. DNS…). Другая нуклеиновая кислота, с рибозой вместо дезоксирибозы и урацилом вместо тимина, стала, соответственно, рибонуклеиновой, РНК. Длинновато и неуклюже – знать бы заранее, каким важным окажется вещество из гноя, можно было бы придумать что-нибудь покрасивее. С другой стороны, если бы эти молекулы назвали “Священной Книгой Жизни” или “Основой Эволюции”, вряд ли нам сейчас было бы проще.
Кстати: ДНК – дезоксирибонуклеиновая КИСЛОТА, поэтому ДНК – ОНА, а не “он” или “оно”. Когда биологи слышат выражения вроде “ваше ДНК”, “человеческое ДНК” – сердятся и могут побить.
Итак, ДНК состоит из четырех нуклеотидов – А, Т, G, С. Отсюда и возникли сомнения в том, что она может быть веществом наследственности. Представлялось невероятным, что четырьмя нуклеотидами можно записать большой объем информации. К тому же считалось, что они регулярно повторяются в линейной молекуле, то есть, по Шрёдингеру, ДНК – это обои, а не гобелен. А вот в белках, например, целых 20 аминокислот – примерно столько букв в английском алфавите, а если учесть модификации аминокислот, то и русский алфавит белки обгонят.
Казалось бы, Левену, открывшему нуклеотиды и даже соединившему их в цепочку, оставался один шаг до открытия структуры ДНК, – но он этого шага не сделал, а предположил, что ДНК состоит из четырехнуклеотидных молекул, по одному нуклеотиду каждого вида. Это вещество представлялось примитивным, в том числе и самому Левену. “Химия нуклеиновых кислот может быть изложена кратко. Действительно, нескольких графических формул, которые не заполнят даже одну печатную страницу, может быть достаточно, чтобы выразить весь запас современных знаний по этому вопросу”[4], – писал он в 1931 г.[5] Парадокс: Левен сильно продвинул вперед изучение структуры нуклеиновых кислот, но он же существенно подорвал репутацию ДНК, поддерживая мнение, что эта неинтересная молекула состоит из четырех нуклеотидов, взятых в равных количествах. Когда решался вопрос о возможном носителе наследственной информации, серьезные люди ставили на белки.
Интересно, что у статьи о структуре “тимонуклеиновой кислоты”[6] (так тоже называли ДНК – ее выделяли из тимуса, и она содержала азотистое основание тимин, которого нет в РНК) два автора: Фибус Левен и некий E. S. London. Это Ефим Семенович Лондон, ленинградский патофизиолог, биохимик и радиобиолог. Чтобы получить удобные для исследования небольшие молекулы, соавторы расщепляли нуклеиновые кислоты в желудочно-кишечном тракте собак, которым вставили фистулы по И. П. Павлову, примерно такие же, как для изучения условных и безусловных рефлексов. (Помните в учебнике: звонит звонок, и у собаки выделяется желудочный сок?) Но эти собаки сами по себе ученых не интересовали, а играли роль своего рода химических реакторов: чем бы ни была эта тимонуклеиновая кислота, в биохимии живой клетки не может быть ничего такого, чего не переварило бы хищное млекопитающее. Вот этих собак и готовил к опыту Е. С. Лондон. Кстати, благодарность Павлову, в лабораторию которого Левен приезжал работать, в статье тоже есть. Левен вместе с семьей эмигрировал из России в Америку в 1891 г., уже взрослым, и свободно говорил по-русски. А современным студентам, изучающим молекулярную биологию с биоинформатикой и свысока глядящим на классическую физиологию, не мешает помнить, что их любимые науки начинались некоторым образом в собачьем кишечнике.
Явление двойной спирали
А затем появились экспериментальные данные в пользу того, что за перенос генетической информации отвечает все-таки ДНК, а не белок. Это показали в 30–40 гг. ХХ в. американские генетики Освальд Эвери, Колин Маклеод и Маклин Маккарти. Они проводили опыты со стрептококком – возбудителем пневмонии, по сути, продолжая исследования, которые еще в 1928 г. провел Фредерик Гриффит, британский военный медик[7].
У Streptococcus pneumoniae есть два штамма – один образует шероховатые колонии, другой гладкие. Как выяснилось позднее, “гладкие” бактерии заключены в полисахаридную капсулу, которая защищает их от иммунной системы хозяина. Поэтому инъекция гладких бактерий убивает подопытную мышку, а животное, которому ввели “шероховатый” штамм, выздоравливает. Гладкие стрептококки погибают при нагревании. Инъекция мертвых бактерий, естественно, не повредит мыши, удивительно другое: когда Гриффит смешал живых безвредных “шероховатых” стрептококков с убитыми “гладкими” и ввел их мыши, животное умерло, а из его организма удалось выделить живых “гладких” стрептококков. Было такое впечатление, что безобидные бактерии пообщались с покойными убийцами и научились у них плохому. Если убавить метафоричности – позаимствовали у них какое-то вещество, которое к тому же сумели передать новым поколениям бактерий, плодящихся в мышке!
Так вот, Эвери, Маклеод и Маккарти сумели определить, что это вещество – ДНК. Только когда они удаляли ДНК из экстракта “гладких” бактерий, его смешивание с безвредными “шероховатыми” оставило их безвредными, инфицированные мыши не погибли. Во всех остальных случаях, когда экстракт очищали от полисахаридов, липидов, белков или РНК, но не от ДНК, эффект был тот же, что и при смешивании с целыми мертвыми бактериями: мыши погибали, из них можно было выделить живой патогенный штамм.
Теперь мы знаем, что бактерии умеют поглощать ДНК из внешней среды и приспосабливать ее для своих нужд: вдруг у покойных собратьев в геноме есть что-то полезное, что позволит выжить, к примеру, при встрече с антибиотиком? Эти прагматичные и безжалостные существа присваивали чужие гены и сами себя превращали в ГМО задолго до компании Monsanto. Собственно, даже не так: на ранних стадиях эволюции обмен генами был рутинным событием и для бактерий в некотором смысле остается рутиной по сей день, а генетическую межвидовую изоляцию “придумали” высшие организмы.
Еще одно подтверждение того факта, что вещество наследственности – именно ДНК, получили американские генетики Альфред Херши и Марта Чейз. За эти опыты Херши получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1969 г. (совместно с Максом Дельбрюком и Сальвадором Лурия, которые доказали другую важную вещь: что мутации у бактерий возникают не “в ответ” на факторы отбора, а случайным образом, в том числе и до того, как эти факторы начнут действовать; отбор лишь сохраняет полезные мутации и отбраковывает вредные). Марту Чейз на премию не выдвинули, дополнительно обидно, что в некоторых русских источниках встречается “эксперимент Херши – Чейза”: об исполнителе эксперимента и соавторе статьи не знают даже, что это женщина.
Для эксперимента Херши и Чейз выбрали бактериофаг Т 4. Бактериофаги – вирусы бактерий, одни из самых простых объектов живой природы. (Хотя насчет “живой” идут бесконечные споры. Вирусы и бактериофаги не могут размножаться вне клетки, к тому же бактериофаг можно закристаллизовать, как, например, молекулу белка. Так, может быть, их следует рассматривать как своего рода паразитические молекулярные комплексы? Не считаем ведь мы живыми прионы – белки с аномальной структурой, которые катализируют превращение нормальных клеточных белков в себе подобные и тем самым вызывают тяжелые заболевания – энцефалопатии). Так или иначе, вирусы и фаги размножаются, потомство у них похоже на родителя, и “вещество наследственности” у них должно быть. Что важно, фаг не проникает внутрь бактерии целиком: он, как шприц, впрыскивает в нее свое содержимое, оболочка остается снаружи клетки, а потом внутри бактерии образуются новые фаги.
Херши и Чейз показали, что фаги вводят в бактериальную клетку свою ДНК, а не белок, с помощью очень изящного опыта. Было известно, что белки содержат кислород, азот, углерод и серу, а нуклеиновые кислоты – кислород, азот, углерод и фосфор. Сера присутствует в белках, но не в ДНК, а фосфор – наоборот, в ДНК, но не в белке. Экспериментаторы получили две разновидности фагов: одни имели в своем составе радиоактивную серу 35S, другие – радиоактивный фосфор 32P. Иначе говоря, в одних фагах радиоактивную метку несли только белки, в других – только ДНК. Так вот, когда бактерий инфицировали фаги первого типа, метка оставалась снаружи, в растворе, а когда второго – меченый фосфор попал внутрь клетки, и новые фаги, которые вышли из этой клетки, тоже были немного радиоактивными. Вывод из этих экспериментальных данных читатель может сделать сам.
Статья Херши и Чейз вышла в 1952 г.[8] В то время уже никто не сомневался, что носителем информации должна быть именно ДНК. Было известно, какие компоненты входят в ее состав, была известна загадочная закономерность, именуемая правилом Чаргаффа: в ДНК попарно равны концентрации гуанина и цитозина, аденина и тимина. Оставалось понять, как все это организовано в пространстве, как устроена молекула. И началась большая гонка, описанная в книге Джеймса Уотсона “Двойная спираль”. Победили в ней, как всем известно, Уотсон и Фрэнсис Крик.
Помогли им в этом рентгенограммы, которые получила Розалинд Франклин – еще одна женщина, сумевшая сделать научную карьеру в эпоху, когда девушка уже могла учиться в Кембридже, но по окончании не могла быть уверена, что получит ученую степень даже при самых блестящих успехах. Рентгеноструктурный анализ – замечательный метод исследования биомолекул. Нужно получить кристалл, направить на него рентгеновское излучение и по картине дифракции лучей рассчитать распределение электронной плотности, координаты атомов, а следовательно, и структуру. Расчеты достаточно сложные, в докомпьютерную эпоху задача была, мягко говоря, нетривиальной. Неорганические кристаллы начали изучать с помощью рентгеноструктурного анализа еще в начале ХХ в. Но потом выяснилось, что кристаллы можно получить и из крупных органических молекул – это трудно, но возможно.
Поглядев на рентгенограммы Розалинд Франклин (особенно важную роль сыграла легендарная “фотография № 51”), Уотсон и Крик выдвинули предположение, что ДНК состоит из двух нитей, соединенных друг с другом азотистыми основаниями и закрученных одна вокруг другой. К 28 февраля 1953 г. Уотсон и Крик уже были уверены в своей правоте; Крик даже заявил в местном пабе, что они “раскрыли секрет жизни”. Их знаменитая статья[9] вышла 25 апреля 1953 г. (таким образом, в 2018 г. человечество отметило 65 лет знакомства с двойной спиралью). Статья заканчивалась горделиво-скромно: “От нашего внимания не ускользнуло, что специфическое взаимодействие, которое мы постулировали, сразу же предоставляет возможный механизм копирования генетического материала”. Действительно, двойная спираль не только соответствовала рентгенограмме, полученной Франклин, но и давала ответ на самый главный вопрос – каким образом информация копируется и передается по наследству!
Морис Уилкинс, получивший Нобелевскую премию 1962 г. вместе с Уотсоном и Криком, не участвовал в построении модели, но работы по изучению структуры ДНК, в том числе и работа Розалинд Франклин, были начаты во многом благодаря ему. Сама же Франклин не дожила до вручения премии – она умерла от рака в 1958 г. в возрасте 37 лет.
Теперь два абзаца биохимии, чтобы подвести итог достижениям отцов (и матерей) молекулярной биологии. Постарайтесь это пережить, а кому не хочется – просто посмотрите на рис. 4 (справа) и переходите к следующей главе. Молекула пятиатомного углевода дезоксирибозы в составе ДНК замкнута в цикл, к ней присоединены азотистое основание и фосфат. Атомы углерода в дезоксирибозе пронумерованы, от одного до пяти; цифры помечены штрихами (в отличие от углеродов азотистого основания, которые пронумерованы без штрихов). К 5’ – углероду присоединен “собственный” фосфат нуклеотида, к 3’ – углероду – фосфат другого нуклеотида, соседа по цепочке. По ним названы и концы нуклеотидной цепи – 5’ – и 3’ – конец. “Начало” цепи, ее “левый” конец (мы читаем слева направо, и последовательность нуклеотидов в ДНК нам удобнее записывать таким же образом) – это 5’ – конец. Любая цепочка ДНК (или РНК) растет от 5’ – к 3’ – концу – новый нуклеотидный остаток всегда присоединяется к 3’ – атому.
Азотистые основания – это то, благодаря чему четыре нуклеотида различаются между собой (остатки дезоксирибозы и фосфаты у всех нуклеотидов одинаковые). Два больших, аденин и гуанин (см. рис. 4), называются пуринами, а два маленьких, с одним шестичленным циклом – тимин и цитозин – пиримидинами. Это и есть те самые “буквы” А, Т, G, С, которыми записывается генетическая информация. Что существенно – этими нуклеотидами две цепочки двойной спирали держатся друг за друга. Напротив аденина всегда стоит тимин, а напротив гуанина – цитозин. Таким образом, последовательность нуклеотидов в одной цепочке однозначно определяет последовательность нуклеотидов в другой цепочке, что позволяет ДНК копироваться.
Теперь мы знаем, что такое ген!
Следующие десятилетия тоже прошли не зря. Структура молекулы – это прекрасно, однако надо было понять, каким образом ДНК копируется (реплицируется), как записанная в ней информация превращается в признаки.