Перечислю эти вопросы.
1. Вирус SARS-CoV-2 попадает в клетку сливаясь с оболочкой клетки или путем эндоцитоза (то есть образования вдавления оболочки клетки внутрь и его последующего отщепления от оболочки; при этом вирус SARS-CoV-2 должен быть внутри образуемого пузырька)?
2. Есть ли рецепторы АСЕ2 на апикальный плазматической мембране эпителиальных клеток человека, а если есть, то на каких клетках и какова их концентрация, как они восстанавливаются после эндоцитоза?
3. В каких клетках его больше?
4. Как вирус взаимодействует с АПМ после приклеивания к рецептору своим зонтиком,
5. Если вирус приникает в клетку путем слияния с плазматической мембраной, то как идет растворение белкового кристалла (капсида), который заключает в себе нуклеиновую кислоту, и как освобождается РНК?
6. Если вирус захватывается клеткой путем эндоцитоза (то есть, образование углубления внутрь цитоплазмы с последующим отщеплением этого углубления с образованием эндоцитозного пузырька или прямой доставки вируса в более крупные вакуоли [эндосомы), то как вирус прорывается через липидную мембрану пузырька/эндосомы в раствор белков цитоплазмы (в цитозоль)?
6. Он синтезирует отрицательную цепь РНК используя свои белки, затем на отрицательной цепи синтезируются копии положительной цепи. На них начинается синтез белков капсида, кристалла, и оболочки. Как?
Как происходит синтез отрицательной РНК, а потом копирование положительной РНК?
7. Синтезирует ли ДНК, которая потом проникает в ядро?
8. Относится ли коронавирус2 к ретровирусам? Скорее всего нет. Есть ли у него обратная репликаза?
9. Как происходит синтез мембранных вирусных белков с трансмембранным доменом и как они транспортируются из эндоплазматического ретикулума, где синтезируюся и как агрегируют другие немембранные белки, образующие зонтикообразные шипы вируса.
Никто не озаботился биологией вируса SARS-CoV-2. ЭМ исследований по вирусу SARS-CoV-2 практически не проводилось. Между тем огромные деньги брошены на создание вакцины, лекарств, но никто не озаботился копеечными экспериментами по взаимодействию вируса и клеток. Без ответа на эти вопросы все эти поиски лекарств, не подтвержденные экспериментами на клетках, не говоря уж о тканях, основная масса денег будет выброшена на ветер, потому что исследователи ищут с закрытыми глазами.
Начну с общих вещей, которые известны о вирусах и которые на основе аналогии могут быть спроецированы на новый коронавирус. Все возможные взаимодействия я буду описывать здесь, исходя из законов дедукции. Если описать все очень и очень упрощенно, то информация такая.
Вход коронавируса в клетки
У коронавируса есть зонтиокообразные шипы, образующие нечто вроде короны. На основе косвенных данных о склеивании белков вирусного шипа и специфического белка АСЕ2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2), был сделан вывод, что коронавирус заражает клетку путем взаимодействия с ACE2. В экспериментах с изолированными белками (не на клетках и не на тканях) обнаружено, что белковые агрегаты шипов коронавируса SARS-CoV-2 способны приклеиваться к участку белка-рецептора под названием АСЕ2, который будто бы в большом количестве имеется на верхушечной (апикальной) поверхности эпителиальных клеток, выстилающих воздухоносные пути. Шипы нового коронавируса склеиваются с АСЕ2 рецептором более сильно, чем подобные шипы вируса SARS-CoV-1. АСЕ2 участвует в регуляции работы сердечно-сосудистой системы, в том числе – и артериального давления. зависит от возраста человека. Возникает вопрос, а что делает АСЕ2 на апикальной поверхности эпителиальных клеток, ведь в воздухе нет ангиотензина. Раз этот белок участвует в регуляции кровообращения, то он он должен присутствовать на апикальных мембранах клеток эндотелия и лейкоцитов. Попадая в кровь, коронавирус, скорее всего, проникает в эндотелиальные клетки и лейкоциты, на поверхности которых, видимо, тоже имеется белок АСЕ2.
Доказательств того, что концентрация белка АСЕ2 на верхушечной поверхности указанных клеток очень высокая, я пока не нашел. Откуда профессор Чучалин (18) взял, что АСЕ2 рецептор находится в эпителиальных клетках альвеол, не ясно. В Интернете я не нашел изображений с иммунофлюоресцентыми или электронно-микроскопическими картинками, где бы реакция была видна именно на альвеолоцитах. По крайней мере, нет снимков, выполненных с высоким разрешением с помощью электронного микроскопа. Прямые эксперименты, доказывающие эти предположения, пока не проведены и это очень странно. Кроме того, нельзя исключить, что первичное проникновение коронавируса происходит в отростки так называемых дендритных отростчатых клеток. Эти клетки являются макрофагами, ответственными за борьбу с бактериями и за иммунитет.
Сейчас считается, что вирус может достигать легочных пузырьков, альвеол, где и происходит насыщение крови кислородом. Строение стенки, отделяющей воздух от текущей крови, сложное, но описывать его у меня нет возможности, отмечу лишь, что для того, чтобы легочные пузырьки не схлопывались, их поверхность, обращенная к воздуху покрыта особым жировым составом, который препятствует схлопыванию. Вещество это называется сурфактант. Знание это нам пригодится для последующего изложения.
Предполагают, что вирус SARS-CoV-2 заражает клетки (какие именно, реснитчатые или клетки Клара или дендритные клетки – точно никто не знает) эпителия воздухоносных путей. Дальше начинается область научных фантазий. Выдвинута гипотеза, что вирус SARS-CoV-2 использует человеческий белок ACE2 в качестве входного рецептора или крючка, за который он прикрепляется к поверхности клетки (19). Это происходит через взаимодействие белков на зонтиково-образном шипе-выросте короны вируса с белком АСЕ2. Белок АСЕ2 является особым детектором ангиотензина, другого белка, который регулирует артериальное давление. Ангиотензин в воздухе не содержиттся. Что делают рецепторы ангиотензина на обращенной в воздух поверхности эпителиальным клеток, никто не знает. Скорее всего, белок АСЕ2 там выполняет какую-то другую функцию. Какую?
Обнаружено поразительное структурное сходство гликопротеинов (белков с полисахаридной цепью) из SARS-CoV-2 S и SARS-CoV-1(S) (19). Способность к склеиванию с белком рецептором АСЕ2 будто бы отражает восприимчивость животного (20, 21).
Высокоразрешающий анализ трехмерной структуры коронавируса показал, что белки на конце шипов, с помощью которых вирус SARS-CoV-2 прикрепляется к клеткам и заражает их, приклеиваются к белку-рецептору АСЕ2 в четыре раза прочнее, чем у родственной разновидности SARS-CoV-1, которая вызвала эпидемию в 2002 году (22, 23). Это приводит к тому, что для заражения одной и той же клетки частиц SARS-CoV-2 нужно значительно меньше, чем того же SARS. Далее начинается область гипотез. Поэтому считается, что новый коронавирус использует АСЕ2 для прикрепления к эпителиальным клеткам легких. (Walls et al., 2020). В эксперименте это не проверено. Тем не менее исследователи фантазируют далее и предполагают, что из-за высокой клейкости шипов нового коронавируса к АСЕ2 способен поражать эпителиальные клетки горла и носа – нетипичные зоны заражения для коронавирусов. Предполагается, (точно никто пока не установил), что частицы коронавируса-2, которые проникают в легкие, с большей вероятностью, чем SARS-CoV-1, закрепляются в верхних дыхательных путях. Это значит, что относительно малое их количество требуется для инфицирования клеток (24).
Будем считать, что склеившись с белком АСЕ2, коронавирус каким-то образом попадает внутрь клетки. Как это делает SARS-CoV-2, никто не знает. Хотя данных о взаимодействии клеток и вируса SARS-CoV-2 нет, но есть отрывочные результаты, полученные на его предшественнике SARS-CoV-1. Скорее всего, коронавирус сливается с плазматической мембраной клетки и выбрасывает белковый кристалл (капсид), содержащий две молекулы РНК (будто бы одиночные цепи РНК нуклеотидов) в цитозоль.
Борьба с клетки с коронавирусом
Клетки защищены от вируса. Каждая клетка нашего организма имеет оружие, позволяющее уничтожить вирус. После того, как вирус проник в эпителиальные клетки воздухоносных путей, сами клетки включают механизмы самозащиты. В клетках есть особые белки-ферменты, так называемые РНКазы, которые режут наследственное вещество вируса нуклеиновая кислота (РНК). Поскольку наш коронавирус имеет в качестве механизма наследования положительную (+) РНК, то после того как вирус попадет внутрь клетки (в так называемый цитозоль), РНК вируса могут атаковать и разрушать имеющиеся РНКазы. Особенно активно клетка борется с двойной цепью РНК, которая, скорее всего (точно пока никто не знает), образуется при синтезе на базе так называемой положительной цепи (+) РНК другой, комплементарной отрицательной цепи (-)РНК, с которой уже и образуются более короткие положительные цепи, так называемые информационные РНК (иРНК). Эти иРНК используют рибосомы (особые машины для синтеза белков на основе информации, предоставляемой информационной РНК) хозяйской клетки для синтеза собственных белков вируса. Потом эти белки сами находят друг друга и формируют новую вирусную частицу. Видимо, РНК вируса защищена. Идет борьба защитных механизмов и числа вирусных частиц. Если частиц больше, чем мощность защиты, то клетка подчиняется вирусу и начинает выделять зрелые частицы. Они могут заражать соседние клетки, а могут погибать, что вызывает кашель. Если вдохнуть еще вирусных частиц, то клетка не справится. Если РНК попадает одна вирусная частица (вирион), то мощности РНКаз хватает, если их попадает много, то РНКазы не справляются. Поэтому если коронавирусные частицы образует и секретирует в просвет только одна эпителиальная клетка то очень быстро происходит разбавление вируса и в каждую следующую клетку попадает мало частиц вируса и клетка их уничтожает теми же РНКазами. Кроме РНКаз есть и другое оружие для борьбы с вирусом. Например, когда идет синтез отрицательной РНК возможно образование спирали из двух комплементарных цепей РНК, наподобие той, что формирует ДНК. Имеются особые белковые комплексы, которые атакуют двойную цепь РНК и разрушают ее.
Выделение коронавируса
Затем клетка под действием команд коронавируса синтезирует много новых вирусных частиц. Они проходят по особому секреторному пути и новый коронавирус выходит из клетки. Среди коронавирусов имеется 3 разных пути выведения вируса из клетки. Судя по картинкам статьи о SARS-CoV-1, эпителиальные клетки могут секретировать вирус в просвет воздухоносных путей без последующего слущивания поврежденной эпителиальной клетки. Всегда ли зараженные этим коронавирусом клетки от него погибают, тоже никто никто не знает. По крайней мере, исследования вируса SARS-Cov-1 и на аденовирусе, который вызывает острое респираторное заболевание, показали, что клетки могут выделять вирус и не разрушаться полностью. Одна клетка пораженная вирусом, может выделять вирус на поверхность воздухоносных путей и вирус может заражать другие клетки. А раз так, то не исключена возможность, что человек выделяет вирус во внешнюю среду, а сам практически не имеет клинических симптомов. Вирус выделяется, скорее всего, в момент, когда слущиваются и разрушаются эпителиальные клетки дыхательных путей и возникает кашель или когда в миндалины прибывают из крови инфицированные клетки иммунной системы, которые и выбрасывают вирус наружу.
Как выделяется из человека, только ли путем синтеза вирусных частиц эпителиальными клетками, а может лимфоциты доставляют коронавирус в миндалины, и затем они секретируют вирусные частицы – не зря тампоном на миндалины нажимают, чтобы выделить вирус. Так как вирус секретируется клетками эпителия и клетки не гибнут, то возможно самоообсеменение и накопление дозы, но если медленно, то защита клеток против РНК вирусов способна разрушить то небольшое число вирионов, которые секретируются. Развитие болезни происходит в пределах одной доли или сегмента. Вирус заполняет сегмент или долю в зависимости от того, где локализуется заражение или как синтезируется или как попадает извне. Если поражение идет не в одной доле, а в нескольких сегментах, то это результат нескольких обсеменений. Но так ли это – не определено.
Способный к инфицированию вирус легко выделялся из образцов, взятых из горла и легких, но не выделялся из образцов кала (будто бы в Италии были слича нахождение вирулентного вирус и в кале – С.М.), несмотря на высокую там концентрацию РНК вируса. То есть, в кал попадал не полностью сформированный вирус. В крови и моче способный к инфицированию вирус ни разу не обнаружили, однако он был выделен из глотки. Популяции вируса последовательно выявлялись в образцах, взятых и горла и горла и легких у одного и того же пациента – это доказывает, что вирус образовывался и в глубоких отделах легких и в верхних дыхательных путях. После 7 дней у 50 % больных (всего 14 дней) появились антитела, однако выделение вируса продолжалось довольно долго и не сопровождалось быстрым его снижением COVID19 может представлять собой легкое заболевание верхних дыхательных путей. В слюне концентрация заразного коронавируса была самой высокой в течение первых семи дней после появления симптомов заражения, а после этого постепенно снижался (25).
Может ли коронавирус SARS-CoV-2 встроиться в наследственный аппарат человека? Ответа на этот вопрос тоже нет. Между тем почти восемь процентов ДНК человека приходится на фрагменты древних вирусов. В человеческом геноме содержится около 98 тысяч эндогенных ретровирусных элементов – последовательностей ДНК древних вирусов, которыми когда-то заражались наши предки. Последний ретровирус, сумевший стать частью нашей ДНК, инфицировал человеческую популяцию около 150 тысяч лет назад. В геном интегрировались только те вирусы, которые обладали механизмом обратной транскрипции, то есть умели из РНК делать ДНК. Поэтому их еще называют ретровирусами. Когда такая частица проникала в клетку, превращала РНК в ДНК, а затем встраивала его в геном и оставалась там, как сейчас выясняется, на века. Встроиться в геном может только ретровирус, который сначала синтезирует ДНК, а уже на ней образует информационные РНК. Скорее всего, коронавирус тоже может встраиваться в наследственный аппарат человека, но только тогда, когда клетка одновременно заражается не только коронавирусом, но одновременно туда попадает как минимум один ретровирус (26).
Патогенез поражений легких
Пока никто не озаботился изучением механизмов воздействия вируса на организм. Я нашел лишь одну публикацию с описанием о патанатомии умершего от COVID19 пациента. Чтобы понять биологию вируса, его пути в клетке и как он заражает и образуется иммунитет, нужны новые и тщательно выполненные эксперименты, Лучше использовать животные модели, чем клеточные. На человеке все это не сделать. Нужны эксперименты на животных. Лучше на обезьянах. Список неясных вопросов внушителен.
1. Может ли зараженная эпителиальная клетка легкого сама синтезировать вирионы и не погибать?
2. Всегда ли коронавирус прорывается в кровь, а если да, то как он это делает?
3. Может ли вирус заражать лейкоциты в крови, как вирус СПИДа?
4. Могут ли лейкоциты и лимфоциты синтезировать вирус и выбрасывать его в кровь?
5. Какой основной путь выделения заразного коронавируса из человека: путем срывания кашлевым воздухом капелек с бронхов, или слюны с миндалин?
6. Почему повышается температура, если в болезни вроде бы не участвуют бактерии?
7. Если же они участвуют, то почему не рекомендуются антибиотики?
8. Чем обусловлена часто высокая скачущая в течение дня темпратура (характерна для сепсиса).
9. Внедряется ли коронавирус в геном человека?
Гиалиновые мембраны
На поверхности бронхов имеется слизь, защищающая клетки от высыхания. Она выделяется бокаловидными клетками и затем особые палочковидные реснички на поверхности эпителия ее удаляют слизь. Сурфактант, препятствующий схлопыванию воздушных пузырьков легкого выделяется клетками Клара и альвеолоцитами 2 типа. Особые замыкающие соединения между мембранами двух соседних клеток, ограничивают диффузию плазме из крови в воздушное пространство альвеолы. Когда их функция нарушается, то происходит фильтрация плазмы крови в альвеолы происходит при разрушении замыкающих соединений в эпителии и эндотелий. Пока эти соединения целы, вирус не может проникнуть в кровь. Когда гибнут эпителиальные клетки, то тоже нарушается барьерная функция стенки между воздухом и кровью.
Если же слущилось много клеток, например, когда много вируса попало в легкие (человек был в толпе зараженных) или он попадал в легкие несколько раз (множественный контакт с пораженными), то начинают повреждаться кровеносные капилляры и к зоне повреждения мигрируют лейкоциты. Они выделают особые белки, в том числе так называемые цитокины – вещества, вызывающие воспалительную реакцию, которые выбрасывают клетки для координации защитных усилий; но они повреждают стенки сосудов. Через поврежденный слой клеток эндотелия (это клетки, которые выстилают кровеносные сосуды и в норме не позволяют плазме крови вытекать из сосуда в ткани органа) в альвеолы начинает вытекать плазма крови. В ней содержится фибриноген – крупный волокнистый белок. Он нужен для того, чтобы закрывать повреждения сосудов. Фибриноген защищает нас от кровотечений. Но в этом случае начинает работать против организма. Поскольку в легком имеются разрушенные клетки, то плазма свертывается (как при кровотечении) и образует на поверхности альвеол так называемые гиалиновые мембраны, которые затрудняют газообмен.
Если клетка слущена, а базальная мембрана, на которой располагалась эта эпителиальная клетка не повреждена, то вирус проникнуть в кровь не может. Если эта базальная мембране перфорирована, то на пути коронавирусов встает эндотелиальный монослой клеток, между которыми тоже есть замыкающие соединения. Наконец только когда и этот барьер разрушен, вирус попадает в кровь.
Проникновение плазмы крови в альвеолы происходило при разрушении замыкающих соединений в эпителии и эндотелии. Это подтверждено следующими эксприментами, хотя и не на коронавирусе. Вирус гриппа А добавлялся к эпителиальным клеткам, выращиваемым на особом фильтре до тех пор пока они не образовывали непроницаемый для электрического тока слой. Под перфорированной пластинкой высаживались другие, на этот раз эндотелиальные, клетки, которые обычно выстилают внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Функция эндотелиальных клеток нарушалась независимо от этого повреждения. Эпителиальные клетки не слущивались, а теряли способность мешать диффузии веществ по промежуткам между клетками, что могло способствовать в реальной ткани легкого диффузии плазмы крови через оба пласта клеток, то есть возникновению интерстициальной (так это назвали в Италии) пневмонии. Другими словами, эпителиальные клетки зараженные аденовирусом существенно повышают проницаемость замыкающих соединений, но клетки не гибнут (27).