В то время как холерный вибрион и кишечная палочка становятся более вирулентными в результате получения новой генетической информации с фагами, штаммы золотистого стафилококка развиваются и изменяются вследствие приобретения дополнительных генетических элементов. Эти носители, каждый из которых часто встречается в бактериальном метагеноме, варьируют от профагов, плазмид, транспозонов до островков патогенности (Baba et al., 2002; Kuroda et al., 2001). Эти носители в совокупности можно считать содержащими «мобилому», библиотеку мобильного генетического материала, который может с замечательной легкостью обмениваться между родственными и неродственными видами бактерий. Мобилома имеет особую ценность для передающихся патогенных бактерий, которые постоянно подвергаются меняющемуся давлению отбора в организмах разных хозяев, а также испытывают воздействия разнообразной антибактериальной терапии. Фаги, плазмиды и островки патогенности являются превосходными носителями генетического разнообразия, так как могут переносить целые гены и генные кластеры между бактериями. Сложные фенотипические признаки могут, таким образом, приобретаться в результате одного, мгновенно происходящего события. Плазмиды уникальны среди этих медиаторов горизонтального переноса генов тем, что не образуют инфекционных внеклеточных форм, опираясь на конъюгацию клеток для мобилизации и переноса. Как таковые плазмиды не считаются вирусами. То, что мы не станем обсуждать их, нисколько не умаляет их важную роль в генетическом обмене между бактериальными клетками.
Фаги отвечают за поддержание микробного разнообразия, и именно они несут главную часть вины за усиление патогенности бактерий в результате конверсии фагов. Фаги облегчают адаптацию к новым хозяевам и новым условиям окружающей среды, поставляя в клетки ассоциированную с ними генетическую информацию, которая включается в хромосому клетки-хозяина. Это включение может стать основой селективного преимущества, если говорить об успешной репликации, для генома бактерии, а также и для ДНК самого фага, который эгоистично пользуется побочным преимуществом репликативного успеха своего хозяина. Фаги едут дальше вместе с геномом хозяина, но могут, время от времени, овладеть полем и стать литическими, в надежде на большой выигрыш, на обретение нового хозяина, где, вероятно, можно будет реплицировать свой геном еще быстрее.
Островки патогенностиэто мобильные генетические элементы, обнаруживаемые в геномах большого числа как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (Novick, Christic, Penades, 2010). Островки патогенности содержат крупные кластеры генов и множество тысяч пар оснований ДНК. Появление столь многих патогенных штаммов золотистого стафилококка за такой короткий период демонстрирует мощное влияние островков патогенности на ее проявления у бактерий. Эти генные кассеты обрамлены повторяющимися последовательностями ДНК и кодируют интегразы, напоминающие таковые умеренных фагов, то есть фагов, которые превращают бактериальные клетки в лизогенные. Этот массивный набор генов кодирует белки с широким диапазоном функций, включая устойчивость к лекарствам, а также содержит гены вирулентности, кодирующие токсины, суперантигены, а также и другие новые генные продукты. Это самостоятельная и весьма ценная генетическая валюта островков патогенности. Их получение бактерией может позволить ей немедленно экспрессировать множество новых генов, что обеспечивает клетку-реципиента новым фенотипом, на который может воздействовать естественный отбор. Распространение островков как паразитов бактериальных геномов зависит от конкурентного преимущества, обеспечиваемого их генетическим грузом, и именно этот груз делает островки столь важным катализатором адаптивной эволюции бактерий. Главным фактором успеха является мобильность островков, ивы угадалиглавным фактором их мобильности являются фаги!
Островки патогенностиэто самостоятельно и независимо развивающиеся эгоистичные генетические элементы, которым для того, чтобы поддерживать свой жизненный цикл, приходится паразитировать на фагах. В этом отношении они подпадают под данное мною широкое определение вирусов. Островок патогенности можно считать окончательным лизогеном. У островков отсутствуют гены, обеспечивающие их мобильность, и им приходится опираться на помощь «хелперного вируса», для того чтобы завершить свой независимый репликативный жизненный цикл (Ram et al., 2012; Tormo-Mas et al., 2010). Инфицирование фагом или индукция фага в клетке-хозяине островков активирует патогенные островкиих гены начинают репликативный цикл и мобилизацию. ДНК островков патогенности вырезается из хромосомы клетки-хозяина, с формированием кольцевидного генома, который реплицируется под влиянием ферментов синтеза ДНК клетки-хозяина. С этого момента продуцируется еще больше генных продуктов островка патогенности, что позволяет использовать структурные белки хелперного фага для построения инфекционных вирусных частиц, содержащих их геном. Эти вирусные частицы продуцируются в больших количествах и являются носителями эффективного горизонтального транспорта генов островков патогенности между бактериями. Репликация островка патогенности разрушительно действует на хелперный фаг, который не способен эффективно продуцировать свои собственные вирионы перед лицом активированного паразита. Это подавление репродукции хелперного фага называют «парадигмой молекулярного паразитизма». Этот механизм был изучен и охарактеризован в изящных исследованиях островков патогенности золотистого стафилококка и хелперного фага 80α (Ram et al., 2012; Novick, Christic, Penades, 2010). Этот треугольник отношений между клеткой-хозяином, островком патогенности и фагом 80α развился в результате длительного совместного процесса; хотя понятно, что бактериальная клетка получает преимущество от присутствия островка патогенности, который, в свою очередь, получает «товары и услуги» от хелперного фага 80α, но не ясно, почему сам фаг играет в эти игры. Он эгоист, и давление естественного отбора, как ожидается, должно повышать его шансы на успешность репликации. Оказывая помощь паразитическому островку патогенности, он вредит этой основополагающей цели, так как в результате репликация фага 80α страдает и образуется меньше инфекционных частиц. Тем не менее было обнаружено множество случаев подобных взаимоотношений, включая различные островки патогенности, использующие разные виды фагов. Поскольку все эти отношения представляются эволюционно стабильными, мы должны заключить, что геном хелперного фага извлекает какое-то репликативное преимущество из этого «любовного» треугольника. Можно утверждать, что уменьшение литической плодовитости фага многократно перевешивается увеличением и здоровьем бактериальной клеточной популяции, что увеличивает число доступных новых хозяев.
Индукция профага и устойчивость к антибиотикам
Мутации, происходящие в результате ошибок при репликации хромосомной ДНК, случаются у бактерий часто благодаря быстрой смене поколений и являются источником генетической вариабельностидвижущей силы адаптивной эволюции. Мутацииэто чаще всего дискретные изменения в нуклеотидной последовательности хромосомной ДНК, которые влияют на функцию единичного гена или белка. Лишь очень редко хромосомные мутации улучшают функции бактериальной клетки и становятся объектом положительного отбора. Можно обоснованно утверждать, что наибольший вклад в эволюцию бактерий вносит приобретение (или потеря) последовательностей ДНК в ходе горизонтального переноса генов. Приобретаются целые гены или кластеры генов, что мгновенно дает бактериальной клетке потенциальные адаптивные признаки. Островки патогенности, присутствующие в вирулентных штаммах стафилококка, являются наиболее мощными переносчиками при горизонтальной передаче генов. Присутствующие в них гены привносят в клетку-реципиент ценные функции, так как кодируют белки, определяющие устойчивость к антибиотикам или повышенную патогенность. За эту валюту островки патогенности покупают преимущества, связанные с положительным влиянием естественного отбора на геном клеток-хозяев. Улучшение репликативной функции клетки-хозяина приносит пользу самому хозяину и его островкам патогенности. В ходе своего развития островки патогенности стали напоминать дефектные лизогенные фаги, зависящие от репликации хелперного фага для завершения своего репликационного цикла и инфицирования других клеток. Следовательно, мобилизация островка патогенности может быть запущена либо инфицированием клетки хелперным фагом, либо индукцией профага. Жестокая ирония судьбы заключается в том, что лечение, которое мы проводим для борьбы с бактериальными инфекциями, само стимулирует опосредуемую фагом трансдукцию ДНК, передачу островков патогенности другим клеткам и конверсию фагов (Modi et al., 2005). Наше лечение способствует усилению горизонтального переноса генов и закладывает фундамент под ускорение адаптивной эволюции тех самых возбудителей, против которых мы боремся.
Сегодня это повод для большой озабоченности. Наша система здравоохранения все чаще обнаруживает, что лечение опасных и угрожающих жизни бактериальных инфекций оказывается неэффективным вследствие развития устойчивости к антибиотикам. Открытие антибиотиков и их польза для человечества стали одним из величайших достижений медицинской науки, но сегодня почва уходит у нас из-под ног. В структуре смертности от инфекционных поражений среди госпитализированных больных в странах Европы и Северной Америки в девяностые годы первенствовали больные с приобретенным иммунодефицитом (зараженные ВИЧ-1); причиной смерти прежде всего становилась оппортунистическая инфекция. Сегодня в этой статистике не упоминаются больные СПИДом, но большая часть смертей обусловлена патогенной бактериальной инфекцией. В недалеком прошлом многие из этих инфекций были легко излечимы. Теперь же мы сталкиваемся с новыми штаммами бактерий, вооруженных способностью противостоять нашим самым мощным антибиотикам. Кризис, вызванный вирулентными, полирезистентными патогенными микроорганизмами, оказался таким угрожающим, что международные сообщества врачей-инфекционистов и специалистов-микробиологов затрубили тревогу, призывая правительства предпринять меры по стимуляции исследований в области борьбы с бактериальными инфекциями (Stagnates, 2004).
Тревожное положение дел обусловлено горизонтальным переносом генов между бактериями разных видов в нашем микробиоме, в окружающей среде и среди патогенных видов бактерий (Wright, 2007; Martinez, 2009; Penades et al., 2015). Избыточное назначение антибиотиков и их неумеренное применение при вскармливании скота внесли весомый вклад в возникновение резистентности к антибиотикам и множеству других лекарств у наших бактерий-комменсалов (Martinez, 2009). Однако даже метагеномы нетронутых уголков природы нагружены генетической информацией, которая готова вмешаться в эволюцию патогенности и устойчивости к антибиотикам (Colomer-Lluch, Jofre, Muniesa, 2011; Wright, 2007). Мобильные генетические элементы, в частности плазмиды, и, определенно, в некоторых случаях опосредованная фагом трансдукциявсе это играет роль в мигрирующей резистентности к лекарствам и вирулентности генов среди комменсалов и изначально патогенных бактерий. Мы живем бок о бок с нашими кишечными микробиомами, и их запас мобильной патогенности и мобильной резистентности к антибиотикам должен особенно нас тревожить. Индукция фага внутри непатогенной симбиотической клетки нашего микробиома является главным феноменом, отвечающим за мобилизацию патологических генов. Эта концепция получила подтверждение в недавно опубликованной работе, выполненной в лабораториях, руководимых доктором Джеймсом Коллинзом в Бостонском университете и на медицинском факультете Гарвардского университета (Modi et al., 2013), в которой рассмотрены механизмы, лежащие в основе переноса резистентности к антибиотикам между бактериями, в норме обитающими в нашем кишечнике.
Известно, что такие стрессовые факторы окружающей среды, как антибиотики, даже в субтерапевтических дозах, которые намного ниже тех, которые назначают для лечения инфекций, могут провоцировать индукцию профагов в кишечных бактериях (Maiques et al., 2006; Ubeda et al., 2005). Нормальное, но редкое стохастическое событие становится частым и определяющим для бактериальной популяции. Исследовательская группа Коллинза попыталась воссоздать условия, возникающие на фоне лечения антибиотиками, использовав в качестве модели мышь. Ученые исследовали нарушения в фагеоме (совокупность последовательностей всех фаговых геномов в образце) в кале мышей, которые получали антимикробные препараты. Используя дозы антибиотиков, эквивалентные тем, что получают люди в процессе лечения инфекционных заболеваний, они выбрали два широко распространенных антибиотика с различными механизмами действия. Первый антибиотикципрофлоксацин из группы фторхинолонов, который подавляет микробную флору на уровне репликации ДНК, угнетая лигазную активность бактериального фермента топоизомеразы II. Как уже было сказано выше, введение фторхинолонов вызывает стрессовый SOS-ответ и индукцию фагов в патогенных энтерогемморагических кишечных палочках. Вторым антибиотиком был ампициллинбета-лактам, который подавляет синтез вещества клеточной стенки бактерий. После лечения антибиотиками из кала мышей выделяли фаговую ДНК и методами глубокого секвенирования определяли фагеом. С помощью компьютерной программы сравнили эти данные с известными ДНК-последовательностями, что позволило определить их происхождение (бактериальное или фаговое), а также функцию соответствующих генов.
Результаты оказались поразительными, а выводы авторов имели огромное значение для нашего понимания ключевой роли фагов в генетическом разнообразии, а также их роли катализаторов генетической адаптации в микробиомах кишечника. У мышей, получавших антибиотики, как получают их больные с инфекциями, наблюдали увеличение количества фаговой ДНК, кодирующей широкий диапазон генных последовательностей, определяющих лекарственную резистентность. К удивлению ученых, однако, эти мобилизованные фаговые гены включали гены, ответственные за резистентность к вводимым антибиотикам, а также гены, связанные с резистентностью ко многим антибиотикам других групп. Эта полная трансдукция ДНК значительно обогатила генетическую сложность фагеома. Эта сложность возникла в результате мобилизации бактериальной ДНК из самых многочисленных родов бактерий, обитающих в кишечнике мышей. Кроме того, трансдукция обогатила пул бактериальных генов, которые обеспечивают выживание в условиях стресса. Например, фагеом мышей, получавших фторхинолон, обогатился генами, отвечающими за репликацию и репарацию ДНК, в то время как фагеом мышей, получавших ампициллин, обогатился генами, отвечающими за включение полисахаридов в клеточную стенку и за белки, катализирующие ее синтез, то есть за процессы, которые нарушаются на фоне приема ампициллина. Индукция фагов и полная трансдукция последовательностей бактериальной ДНК благоприятствуют генам, которые придают бактериям адаптивную способность переносить стрессовые ситуации. Исследователи также выявили фрагменты ДНК, содержащие фаговые и бактериальные последовательности, соединенные в одну крупную молекулу. Эти фрагменты ДНК свидетельствуют об инфекции и рекомбинации между геномами частицы фага и бактерии. Примечательно, что были обнаружены рекомбинантные ДНК, происходящие из фага и бактерии, что говорит о том, чтои это было неожиданностьюимеют место инновационные взаимодействия между клеткой-хозяином и фагом. Представляется, что в подвергнутой воздействию стресса экосистеме кишечника фаги не только выполняют функцию адаптивного генного банка, но и обеспечивают облегченный доступ к этому генетическому инвентарю, упрощая взаимодействие фага и клетки-хозяина.
Влияние фагов на эволюцию, усиление вирулентности и формирование полирезистентности, как выяснилось, усиливается в условиях воздействия антибиотиков на кишечную микрофлору. Дестабилизирующий эффект введения антибиотиков на кишечный микробиом повышает вероятность колонизации микроорганизмами новых ниш и расширения присутствия патогенных микробов в кишечной экосистеме. Такая дестабилизация нормальной флоры нашего кишечника является главной причиной патологического размножения таких оппортунистических микроорганизмов, как Clostridium difficile, которые в обычных условиях ничем себя не проявляют (Young, Schmidt, 2004; Owens et al., 2008). Работа Коллинза показывает, что антибиотики, таким образом, провоцируют непредсказуемые изменения в экосистеме нашего кишечника. Беспорядочная, хаотичная, опосредованная фагами мобилизация генов резистентности и вирулентности в микробиоме кишечника является весьма полезным открытием. Эта мобилизация потенциально способна ускорить микробную эволюцию и возникновение адаптивных патогенных вариантов с новой вирулентностью и новыми фенотипическими проявлениями резистентности.
Пассивным помощником патогенных бактерий является, без сомнения, огромный массив генетической информации, доступной для вирусного и бактериального метагеномов. Совокупно они действуют как резервуар генетической адаптации, стимулируемой и подстегиваемой репликацией, опосредуемой фагами. Этот набор генетической информации может быть мобилизован и использован для адаптивной эволюции. Роль горизонтального переноса генов в бактериальной эволюции так важна, что именно он является первичным и главным движителем расхождения видов, а часто и главным фактором микробного видообразования. Несомненно, бактериальные виды должны иметь совокупность генов, которые составляют ядерную специфичность данного вида, но границы этого ядра стерты почти неограниченным поступлением дополнительной мобильной генетической информации. Собирательное название всей этой огромной совокупностимикробный пангеном.