При старении ухудшаются состояние и функции других систем, тканей и органов организма, в том числе органы чувств, сердечно-сосудистая, вегетативная и иммунная системы, пищеварительные органы, органы эндокринной системы и др. (Руководство по геронтологии, 2005).
Сейчас уже можно однозначно утверждать, что старческие изменения не могут быть полностью устранены диетами, голоданием, настоями трав, лекарствами, витаминами или препаратами, физическими упражнениями и тому подобным.
Как же можно остановить старение? В следующих разделах будет описано, что первый шаг уже сделан и это клеточная терапия кожного покрова собственными клетками. Следующие шаги будут направлены на совершенствование такой методики и на распространение ее на другие ткани, системы и органы человека.
ХАРАКТЕРИСТИКА КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ПРИЧИНЫ ЕЕ СТАРЕНИЯ
Основными клеточными элементами соединительной ткани являются фибробласты. Фибробласты это клетки мезенхимального происхождения, круглой или удлиненной, веретенообразной плоской формы с отростками и овальным ядром (Рис. 3). Состояние и функция основных внеклеточных компонентов соединительной ткани, коллагеновых, эластических и ретикулярных волокон и межклеточного матрикса зависят от функциональной активности фибробластов. В результате дифференцировки фибробласты превращаются в менее активные зрелые клетки фиброциты.
Фибробласты являются основными клетками среднего соединительнотканного слоя кожи, называемого дермой (Рис. 4, 5). Основная функция фибробластов дермального слоя кожи участие в метаболизме клеточного вещества. Фибробласты кожи синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса и ферменты. Этот процесс происходит непрерывно, и благодаря ему межклеточное вещество постоянно обновляется. Особенно интенсивно протекает метаболизм гиалуроновой кислоты (Крихели и др., 2004). Как и во всех органах и тканях человеческого организма, в коже происходят возрастные изменения в течение жизни.
В стареющей коже уменьшается толщина дермы, содержание влаги в ней падает, в результате кожа теряет упругость и эластичность. Следствием этого является образование морщин. Старение кожи на различных участках тела протекает неравномерно. Особенно быстро стареют открытые участки кожи. Причина этого, как описывалось выше, фотостарение (облучение солнечным светом), а также атмосферные воздействия. В то же время на закрытых областях возрастные изменения кожи менее выражены.
Существует мнение, что одной из основных причин старения кожи является снижение способности фибробластов кожи к делению (размножению) с возрастом. В результате этого процесса количество живых фибробластов в коже уменьшается, и они становятся менее активны. Следовательно, если каким-либо образом стимулировать пролиферативную и синтетическую активность фибробластов, то можно улучшить состояние кожи (Крихели и др., 2004).
Кроме того, в коже уменьшается количество коллагеновых волокон и снижается их гидратируемость, они утрачивают способность к разбуханию и становятся ригидными, в результате уменьшается тургор, происходит образование морщин. Одновременно кожа теряет липиды, нарушается ее защитная мантия, она становится легко ранимой, шелушится (Руководство по геронтологии, 2005).
Так как количество и активность фибробластов снижается, оставшиеся не могут компенсировать происходящие старческие изменения кожи. Поэтому, если увеличить число молодых активных клеток фибробластов в коже, то логично ждать улучшения ее состояния вследствие того, что фибробласты будут вырабатывать молодой коллаген и эластин, а это повысит упругость кожи, ее тургор, в результате чего морщины разгладятся.
МЕТОДЫ ОМОЛОЖЕНИЯ КОЖИ
Для коррекции возрастных изменений кожных покровов в настоящее время используются самые разнообразные методы (пилинги, шлифовка, лифтинг и др.) и препараты (токсин ботулизма, компоненты внеклеточного матрикса и соединительной ткани и т.д.). Многие из этих методов направлены на стимуляцию собственных клеток кожи, в частности, фибробластов. Однако можно решить проблему и другим образом увеличить количество фибробластов в коже с помощью их пересадки в те места, где это необходимо.
МЕТОДЫ ОМОЛОЖЕНИЯ КОЖИ
Для коррекции возрастных изменений кожных покровов в настоящее время используются самые разнообразные методы (пилинги, шлифовка, лифтинг и др.) и препараты (токсин ботулизма, компоненты внеклеточного матрикса и соединительной ткани и т.д.). Многие из этих методов направлены на стимуляцию собственных клеток кожи, в частности, фибробластов. Однако можно решить проблему и другим образом увеличить количество фибробластов в коже с помощью их пересадки в те места, где это необходимо.
Прежде чем пересадки фибробластов стали реальностью, исследователям пришлось решать много методических вопросов, в том числе вопросы безопасности подобных процедур.
Значительный прогресс в этом направлении был достигнут, когда исследователи научились культивировать, т. е. поддерживать жизнеспособность фибробластов вне организма, или другими словами in vitro. В 1961 г. L. Hayflick и P. S. Moorhead (Hayflick, Moorhead, 1961) представили данные о том, что даже в оптимальных условиях культивирования in vitro фибробласты эмбриона человека способны делиться только ограниченное число раз (50 ± 10). В последующих исследованиях это наблюдение было многократно воспроизведено. Последняя фаза жизни клеток в культуре была определена как клеточное старение, а сам феномен получил по имени автора название лимит Хейфлика.
После установления лимита Хейфлика в результате многочисленных исследований было выявлено, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют ограниченную продолжительность жизни. Кроме того, у нормальных клеток отсутствуют онкогенные потенции. Эти требования к культурам нормальных клеток были оформлены в виде нормативных документов.
При соблюдении этих требований появилась возможность использования культивируемых вне организма фибробластов человека для производства иммунобиологических медицинских препаратов, а затем и для терапевтических целей. Научные исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на основе стволовых клеток.
В настоящее время можно выделить два основных подхода к лечению кожи с помощью препаратов, содержащих живые фибробласты. С одной стороны, широкую известность получили методики и препараты для лечения дефектов кожи раневого и ожогового характера с помощью культур аллогенных (другого организма) эмбриональных фибробластов. Альтернативой этим методикам является возможность использования аутогенных (собственных) фибробластов человека для заместительной клеточной терапии кожных покровов (Згурский, 2004).
Считается, что наилучшие результаты клеточной терапии получаются при использовании культур эмбриональных фибробластов, которые имеют больший пролиферативный потенциал по сравнению с культурами от взрослых доноров. Однако, применение клеток, полученных из эмбрионов, имеет ряд ограничений, в том числе этического характера. В то же время накапливаются данные, что собственные фибробласты сохраняют свой потенциал при старении, несмотря на уменьшение их числа в стареющем организме (Терехов, 1984; Згурский, Прохоров, 2020).
Для достижения первичных результатов необходимо получить культуры фибробластов от взрослых доноров. Было установлено, что пролиферативные способности полученных фибробластов по сравнению с эмбриональными кожными фибробластами вполне достаточны, чтобы использовать их для клеточной терапии (Згурский, 2004).
Методика получения и культивирования аутогенных фибробластов кожи
Клеточный материал для получения культуры аутогенных фибробластов берут путем биопсии кожи (срез небольшого участка кожи размером примерно 0,5 см2) пациента в области предплечья или в заушной области при местной анестезии.
Получение и культивирование фибробластов из биоптата кожи проводят по стандартной методике. Для получения первичной культуры клеток ткань промывают физиологическим раствором, содержащим антибиотики, помещают в стерильную чашку Петри и обрабатывают раствором, содержащим трипсин или коллагеназу (оба ферменты). Под действием раствора ткань размягчается и из нее на дно чашки выходят живые клетки (фибробласты). Затем в чашку заливают питательную ростовую среду (см. ниже) и помещают в СО2-инкубатор (специальный плотно закрывающийся шкаф, в котором поддерживается постоянная температура 370С и повышенная концентрация (57%) углекислого газа в воздухе (Рис. 6); обычная концентрация СО2 в атмосфере 0,030,04%, при которой фибробласты расти не могут. Клетки начинают размножаться и после заполнения всей чашки фибробластами их снимают с ростовой поверхности смесью растворов Версена (раствор ЭДТА этилен диамин тетрауксусной кислоты и неорганических солей) и трипсина. Клетки первичной культуры центрифугируют, отмывают от компонентов раствора и суспендируют в среде культивирования.