В присутствии динитрофенола, вызывающего полное разобщение дыхания и фосфорилирования, потребление кислорода митохондриями животных в терминальной фазе истощающего стресса (72 ч опыта) снижено в 1,75 раза (табл. I-1). Это означает, что изменения, выявляемые в митохондриях, изолированных из сердца животных при длительной иммобилизации, выражаются не только в нарушении сопряжения окисления с фосфорилированием, но и в нарушении самого окисления, т. е. транспорта электронов в дыхательной цепи. В соответствии с современными представлениями такие нарушения могут быть обусловлены повреждением липидного бислоя митохондриальных мембран продуктами перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также чрезмерной активацией фосфолипаз сердечной мышцы и детергентного действия избытка жирных кислот, возникающего при стрессе в результате повышения секреции катехоламинов [98]. Как видно из табл. І-2, с увеличением экспозиции иммобилизации крыс содержание в сердце продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид) неуклонно возрастает (с максимумом к 72 ч опыта), а уровень антиоксидантной защиты кардиомиоцитов (активность каталазы, супероксиддисмутазы и содержание эндогенного токоферола) пропорционально падает, т. е. имеет место прогрессирующее нарушение исходной сбалансированности между ферментными системами генерирования и детоксикации липопероксидов за счет стрессзависимого снижения антиоксидантного статуса организма [138].
Предварительное введение нетоксичных доз природных и синтетических антиоксидантов (токоферол, ионол) предупреждает типичную для тяжелого ЭБС активацию ПОЛ в мышце сердца, мозге и других органах. В результате ингибирования ПОЛ не развивается повреждений мембран кардиомиоцитов, нарушения работы Санасоса, окислительного фосфорилирования в митохондриях, избыточной потери миокардом ферментов, транзиторного повреждения и последующей репарации ДНК; предотвращаются депрессия сократительной функции миокарда и постстрессорное снижение устойчивости сердца к гипоксии. Эти факты свидетельствуют о том, что активация ПОЛ действительно составляет ключевое звено патогенетической цепи стрессорной альтерации кардиомиоцитов. Блокирование ПОЛ, устраняющее возможность накопления гидроперекисей липидов в мембранных структурах кардиомиоцитов, очевидно, приводит к стабилизации их липидного бислоя и этот мембранотропный эффект составляет суть кардиопротекторного действия антиоксидантов [98]. В механизме снижения уровня ПОЛ под влиянием антиоксидантов, содержащих гидроксильные группы фенольного типа, наряду с осуществлением их скевенджерной функции «ловушек» супероксидных радикалов важную роль может играть и собственная антистрессорная активность препаратов.
Предварительное введение нетоксичных доз природных и синтетических антиоксидантов (токоферол, ионол) предупреждает типичную для тяжелого ЭБС активацию ПОЛ в мышце сердца, мозге и других органах. В результате ингибирования ПОЛ не развивается повреждений мембран кардиомиоцитов, нарушения работы Санасоса, окислительного фосфорилирования в митохондриях, избыточной потери миокардом ферментов, транзиторного повреждения и последующей репарации ДНК; предотвращаются депрессия сократительной функции миокарда и постстрессорное снижение устойчивости сердца к гипоксии. Эти факты свидетельствуют о том, что активация ПОЛ действительно составляет ключевое звено патогенетической цепи стрессорной альтерации кардиомиоцитов. Блокирование ПОЛ, устраняющее возможность накопления гидроперекисей липидов в мембранных структурах кардиомиоцитов, очевидно, приводит к стабилизации их липидного бислоя и этот мембранотропный эффект составляет суть кардиопротекторного действия антиоксидантов [98]. В механизме снижения уровня ПОЛ под влиянием антиоксидантов, содержащих гидроксильные группы фенольного типа, наряду с осуществлением их скевенджерной функции «ловушек» супероксидных радикалов важную роль может играть и собственная антистрессорная активность препаратов.
Предварительное введение ионола (2-6-дитретбутил-4-метилфенола) заметно уменьшает амплитуду стрессорной реакции в ответ на эмоционально-болевое воздействие: убыль катехоламинов в надпочечниках у стрессированных животных уменьшается в 2 раза, а подъем концентрации кортикостерона в плазме, обычно наблюдаемый после ЭБС, практически отсутствует [98].
Отсюда не исключено, что в спектре защитного действия любого стресслимитирующего фактора должны присутствовать мембранопротекторные эффекты, реализуемые через снижение уровня ПОЛ, пропорциональное степени индуцированной резистентности организма к данному виду стресса.
Действительно, как видно из табл. І-2, тиамин, который не содержит гидроксильных групп фенольного типа и практически не обладает антиоксидантными свойствами [149], но способный эффективно снижать уровень гормоносинтеза в секреторных клетках коры надпочечников [13] и хромаффинных клетках мозгового вещества адреналовых желез [17] в условиях развития реакции напряжения, тем не менее существенно ограничивает степень активации ПОЛ в миокарде при иммобилизации крыс. Истощающий стресс на фоне тиамина приводит к заметно меньшему приросту продуктов ПОЛ (ДК, МДА) в сердце и соответственно меньшему снижению антиоксидантного потенциала кардиомиоцитов (активности каталазы, супероксиддисмутазы и содержания токоферола), чем у животных, не получавших витамин В1. Поскольку аналогичное действие на антиоксидантный статус организма в принятых условиях оказывает адреналэктомия (табл. I-2), есть все основания считать, что ограничение ПОЛ под влиянием тиамина лимитируется соответствующим снижением уровня стрессорных гормонов в крови крыс, т. е. по сути является антистрессорным эффектом.
Таблица I-2.
Влияние тиамина (Т) на про и антиоксидантный статус кардиомиоцитов в динамике ИС
* Достоверные изменения p < 0,05.
Существуют различные варианты гипотезы перекисной гибели клеток. В модели Ф. Меерсона, адаптированной к кардиомиоцитам, важная роль отводится «липидной триаде», элементы которой при стрессе формируют своеобразный порочный круг с взаимным усилением друг друга: активация ПОЛ лабилизация лизосом кардиомиоцитов освобождение лизосомальных фосфолипаз гидролиз встроенных в мембрану фосфолипидов образование свободных жирных кислот (ЖК) и лизофосфатидов нарушение упорядоченности бислойных мембран увеличение проницаемости их мембран для Са2+ активация фосфолипаз, что в конечном итоге приводит к необратимому повреждению сарколеммы и внутриклеточных мембранных структур и апоптозу [98].
Известно, что эффективность функционирования биологических мембран существенно зависит от физического состояния их липидов. Одним из информативных методов оценки физического состояния липидов биологических мембран является метод флуоресценции, с использованием флуоресцентных зондов [52]. Мы изучали физические свойства (микровязкость) свободных (липидный бислой) и связанных с белками (анулярных) липидов мембран митохондрий и эндоплазматического ретикулума кардиомиоцитов сердца крыс при иммобилизационном стрессе до и после введения тиамина.
Использование гидрофобного флуоресцентного зонда пирена, инкорпорированного в зону жирнокислотных цепей фосфолипидов, позволяет оценить физические свойства мембраны в местах локализации зонда.
Причем перекрывание спектров поглощения зонда и эмиссии триптофанилов дает возможность селективно, за счет индуктивно-избирательного переноса энергии (ИРПЭ), возбуждать молекулы пирена, расположенные в непосредственной близости к мембранным белкам (анулярные липиды). Возбуждение непосредственно самой молекулы пирена позволяет характеризовать состояние бислойных или свободных липидов [114].
Как видно из табл. I-3, микровязкость свободных липидов (липидного бислоя) микросомальных мембран кардиомиоцитов при хроническом стрессе уменьшается. Минимальное значение регистрируется уже после первого часа иммобилизации и остается на таком уровне до 24 ч опыта. В области анулярных липидов микровязкость также уменьшается, но минимум достигается после 12-часового стрессирования. Микровязкость бислойных липидов митохондриальных мембран изменяется аналогичным образом.
Уменьшение микровязкости окружения зонда, встроенного в липиды микросомальных и митохондриальных мембран, свидетельствует об увеличении их текучести. Повышение текучести мембран мозга и сердца [72] наблюдается при старении и гипокинезии. Одной из причин этого явления может быть изменение состава фосфолипидов. Показано, что причиной увеличения текучести липидного бислоя мембран саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов является увеличение количества длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов [68].
Таким образом, иммобилизационный стресс приводит к изменению физических свойств липидного матрикса мембран эндоплазматического ретикулума и митохондрий сократительных клеток миокарда. Текучесть липидного бислоя и анулярных липидов увеличивается в течение 72-часового стрессирования и более выражена для митохондриальных мембран (табл. I-3). Вероятно, эти изменения могут привести к нарушению функциональных свойств мембран, в частности транспорта ионов кальция [75].
Приведенные в табл. І-3 результаты свидетельствуют, что у животных, не получавших тиамин, микровязкость свободных липидов микросомальных мембран в миокарде после одного часа стрессирования уменьшается в 4 раза, а у витаминизированных только в 1,5 раза. В дальнейшем на протяжении всего эксперимента она остается практически на одном уровне.
Таблица І-3.
Влияние тиамина (Т) на физические свойства липидов митохондриальных мембран кардиомиоцитов крыс при ИС
* Достоверные изменения р < 0,05.
Аналогичные изменения микровязкости наблюдаются для анулярных липидов микросом, свободных и анулярных липидов митохондрий. Во все сроки иммобилизации тиамин снижает текучесть липидов микросомальных и митохондриальных мембран (для анулярных липидов максимальное снижение наблюдается через 1 ч и 48 ч опыта). Очевидно, его введение приводит к стабилизации флуктуаций жирных кислот в составе фосфолипидов изучаемых мембран за счет снижения их фосфолипазного расщепления [84].
Фосфолипидам митохондрий обычно отводят роль материала, скрепляющего глобулы белков, которые образуют структурную основу митохондриальной мембраны. Разрушение комплекса белок фосфолипид белок будет иметь следствием снижение той жесткости мембраны, которая необходима для поддержания высокого гидростатического давления в матриксе и препятствует осмотическому набуханию органелл [350]. Предполагается, что молекулы фосфолипидов-«скрепок» составляют ту небольшую часть фосфолипидного фонда митохондриальных мембран, которая специфически подвержена
действию фосфолипазы митохондрий [202]. Гидролиз одной из сложноэфирных связей между глицерофосфатом и жирной кислотой, катализируемой этой фосфолипазой, приводит к распаду тройного комплекса, расхождению исходно фиксированных белковых глобул, уменьшению жесткости мембраны в целом и набуханию митохондрий [350].