Отмывка пикриновой кислоты производится почти исключительно 70 80 %-м спиртом, но не водой, так как вызванные пикриновой кислотой осадки большей частью нерастворимы в воде. Кроме того, при помещении в воду наступает набухание соединительной ткани. При отмывке следует несколько раз сменить спирт, однако обычно нет необходимости полностью вымывать пикриновую кислоту (Ромейс Б., 1954).
Желтая окраска срезов после регидратации может быть устранена обработкой в 5 %-м водном растворе тиосульфата натрия.
Пикриновая кислота формалин-уксусная кислота. Эта предложенная Буэном смесь принадлежит к лучшим фиксирующим жидкостям. Относительно быстро проникающий фиксатор рекомендуется как для обзорных препаратов, так и для специальных исследований. Жидкость Буэна пригодна и для фиксации эмбрионов. Окрашиваемость тканей очень хорошая. Коллагеновые волокна в ней несколько набухают; жиры и липоидные вещества сохраняются хуже. Считается, что жидкость Буэна недостаточно хорошо фиксирует ткани почки (Меркулов Г. А., 1969).
Жидкость Буэна. Фиксатор готовится ex tempore из насыщенного 1,2 %-го водного раствора пикриновой кислоты, концентрированного формальдегида (35 40 %) и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15: 5: 1. Продолжительность фиксации около 24 ч при комнатной температуре. Возможно и более длительное (до нескольких суток) пребывание срезов в жидкости Буэна без ухудшения качества последующей окраски. После фиксации полагаются короткая промывка в воде (1 15 мин) и более длительная (до суток) в 70 %-м этаноле, обезвоживание и заливка в парафин. Заливка в целлоидин нежелательна. После фиксации в жидкости Буэна срезы ярко окрашиваются кислыми красителями (эозином и др.) и несколько хуже воспринимают основные анилиновые красители. В связи с этим для окончательного удаления пикриновой кислоты после депарафинирования рекомендуют обработать срезы в 0,2 %-м водном растворе карбоната лития в течение 30 с (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).
При заливке в целлоидин материала, фиксированного по Буэну, часто обнаруживается, что даже после длительного пребывания в растворе целлоидина препараты пропитываются не полностью и крошатся при резке. Для устранения этого недостатка рекомендуется после 96 %-го спирта переносить препараты на 10 48 ч в следующую масляную смесь: 10 мл кедрового масла, 80 мл абсолютного спирта, 20 мл ориганового масла, 10 мл азотной кислоты. После этого объекты снова помещают на 24 48 ч в 96 %-й спирт, который сменяют 2 3 раза. Далее проводят те же манипуляции, как при целлоидиновой заливке. После такой обработки препараты хорошо режутся и не крошатся. Предполагается, что хрупкость объектов обусловлена образованием пикрата калия, который препятствует проникновению целлоидина; масляная смесь, содержащая азотную кислоту, растворяет и удаляет его (Ромейс Б., 1954).
1.2.9. Другие фиксаторы общего назначения
Полигексаметиленгуанидин относится к фиксаторам общего назначения, предложенным в последние годы. Он применяется (Аничков Н. М.[и др.], 2010) в виде 10 %-го водного раствора (время фиксации 5 сут).
Ацетат меди (Арасланов С. А. [и др.], 2007), тоже фиксатор общего назначения, применяется в виде 0,2 М водного раствора, время фиксации в нем составляет 7 сут.
1.3. Фиксация материала для иммуноцитохимического исследования
Проведение иммуноцитохимического исследования возможно после фиксации материала в нейтральном растворе формалина, спирт-формалине, жидкостях Карнуа и Буэна, фиксаторах СФУ и B5. Наиболее устойчивые антигены могут быть выявлены и после продолжительной фиксации в обычном (не нейтральном) 10 %-м растворе формалина. Однако при использовании этих фиксаторов часть антигенов маскируется в связи с конформационными изменениями белков, экстракцией липидов, образованием перекрестных сшивок, модифицирующих антигенные детерминанты, снижается интенсивность иммуноцитохимической реакции на большинство антигенов.
С целью улучшить сохранность тканевых антигенов были предложены специальные фиксирующие смеси, которые наряду с фиксацией материала обеспечивают сохранность отдельных групп антигенов. Их использование вместо формалина позволяет во многих случаях добиться более эффективного выявления различных тканеспецифических белков, ферментов и онкомаркеров.
Цинк-формалин имеет наибольшее значение среди предложенных фиксаторов, поскольку он обеспечивает качество фиксации, свойственное формалиновым растворам. При применении обзорных и наиболее распространенных специальных способов окраски тинкториальные свойства тканевых элементов существенно не меняются, так что при проведении обычного патогистологического исследования не возникает дополнительных трудностей. Кроме того, для приготовления цинк-формалина не требуется использования дефицитных или дорогостоящих реагентов.
Цинк-формалиновый фиксатор с хлоридом цинка (Naish S. J., 1989) готовят, растворяя в 2 л дистиллированной воды 50 г хлорида цинка и добавляя 300 мл концентрированного раствора формальдегида и 1,9 мл ледяной уксусной кислоты. Этот фиксатор обычно применяют для иммуноцитохимических исследований, поскольку он хорошо сохраняет белки, ассоциированные с клеточными мембранами. Продолжительность фиксации не более 24 ч при комнатной температуре. Приготовленный фиксатор может храниться в течение нескольких недель.
Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка (Kiernan J. A., 2008). Для приготовления фиксатора берут 900 мл дистиллированной воды, 100 мл концентрированного раствора формальдегида и 10 г сульфата цинка (ZnSO44··7H2O). Считается, что лучший результат фиксации антигенов получается при pH = 4,0 6,5. Если pH приготовленного раствора выходит за указанные границы, следует использовать 1 М растворы HCl и NaOH, которые добавляют к раствору фиксатора по каплям до необходимого уровня pH. Цинк-формалиновый фиксатор с сульфатом цинка может быть использован для перфузионной фиксации лабораторных животных. Для иммерсионной фиксации небольших объектов достаточно 6 8 ч. Объекты можно оставить в фиксаторе на срок до 1 нед. После фиксации в цинк-формалине можно заливать объекты в парафин (после промывки в воде), изготовлять срезы незалитого материала на замораживающем микротоме и криостате.
Раствор параформальдегида с пикриновой кислотой, по Замбони. Первоначально этот фиксатор был предложен (Zamboni L. [et al.], 1967) для электронной микроскопии. Способ приготовления: 20 г параформальдегида растворяют в насыщенном водном растворе пикриновой кислоты (150 мл). Раствор нагревают до 60 °C. Для улучшения растворения параформальдегида необходимо добавить в раствор 2 5 капель 1 М (4 %) водного раствора NaOH. После растворения параформальдегида раствор фильтруют, охлаждают и доводят до 1 л при помощи фосфатного буфера.
Приготовленный фиксирующий раствор стабилен в течение 12 мес. Особенно его рекомендуют для фиксации препаратов головного мозга и почки (Kiernan J. A., 2008). Время фиксации составляет 8 24 ч. По окончании фиксации рекомендуется промывка в воде, после чего для обезвоживания используют 70 %-й этанол.
Фосфатный буфер Замбони. Способ приготовления: однозамещенный фосфат натрия (NaH2PO44··H2O) 3,31 г, двузамещенный фосфат натрия безводный (Na2HPO4) 17,89 г, дистиллированная вода до 1 л.
Цинк-этанол-формальдегид (Kоржевский Д. Э. [и др.], 2006). Способ приготовления: для приготовления 1 л фиксатора берут 900 мл 96 %-го этанола, 100 мл концентрированного раствора формальдегида и 10 г хлорида цинка. Готовый раствор сохраняет свои свойства в течение 4 5 нед. Продолжительность фиксации составляет 18 24 ч. Поскольку одновременно с фиксацией материала происходит его обезвоживание, после завершения фиксации кусочки перекладывают сразу в 96 %-й этанол. Этот фиксатор рекомендован для обработки головного и спинного мозга, поскольку наряду с улучшением сохранности тканевых антигенов обеспечивает высокое качество окраски по Нисслю.
1. Аничков Н. М., Данилова И. А., Васильев О. Д. [и др.]. Применение раствора полигуанидина для фиксации биологических и анатомических объектов // Морфология. 2010. Т. 137, 1. С. 58 61.
2. Арасланов С. А., Зайцев В. Б., Мешандин А. Г. [и др.]. Новый фиксатор биологического материала // Морфология. 2007. Т. 131, 1. С. 79 81.
3. Артишевский А. А., Леонтюк А. С., Слука Б. А. Гистология с техникой гистологических исследований. Минск: Вышэйшая школа, 1999. 236 с.
4. Вайль С. С. Практическое руководство по патолого-гистологической технике. Л.; М.: ОГИЗ, 1934. 228 с.
5. Коржевский Д. Э., Гиляров А. В. Основы гистологической техники. СПб.: СпецЛит, 2010. 96 с.
6. Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. 2006. Т. 129, 1. С. 85 86.
7. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 643 с.
8. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. Л.: Медицина, 1969. 423 с.
9. Ромейс Б. Микроскопическая техника: пер. с нем. М.: Изд-во иностр. литер., 1954. 718 с.
10. Bancroft J. D., Gamble M. Theory and practice of histological techniques. Edinbugh; London; N. Y.: Churchill Livingstone, 2002. 796 p.
11. Kiernan J. A. Histological and histochemical methods. Theory and practice. London: Scion Publishing Ltd, 2008. 606 p.
12. Naish S. J. Immunochemical staining methods. Glostrup: DAKO Corporation, 1989. 41 p.
13. Zamboni L., DeMartino C. Buered picric acid formaldehyde: a new rapid xative for electron microscopy // J. Cell Biol. 1967. Vol. 35. P. 148A.
Глава 2
ДЕКАЛЬЦИНАЦИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ
2.1. Общие сведения о декальцинации
Для изучения гистологических препаратов плотных кальцифицированных тканей могут быть изготовлены шлифы, которые позволяют сохранить минеральные компоненты, придающие тканям высокую плотность. Однако эта процедура трудоемка и требует специального оборудования. На обычном микротоме невозможно изготовить срезы недекальцинированной костной ткани. Перед заливкой таких объектов в парафин или целлоидин производят декальцинацию, в ходе которой из объекта удаляются соли кальция, он теряет свою плотность и становится пригодным для последующей микротомии. Как правило, декальцинацию проводят после полной фиксации ткани. Однако существуют методы, благодаря которым декальцинация начинается одновременно с фиксацией. В этом случае фиксирующая среда должна содержать декальцинирующее вещество. После декальцинации в кислотах желательна тщательная промывка материала в слабощелочных растворах на протяжении 1 3 ч.