Третья схема:
этанол 80 %-й 18 24 ч;
этанол 96 %-й (I) 18 24 ч;
этанол 96 %-й (II) 18 24 ч;
метилсалицилат (или метилбензоат) этанол 96 %-й (1: 1) 2 ч;
метилсалицилат (или метилбензоат) 12 24 ч.
В метилсалицилате материал можно долго хранить без ухудшения качества препаратов (Коржевский Д. Э., 1996; Коржевский Д. Э. [и др.], 2008). Так как проводка через метилсалицилат и метилбензоат приводит к смягчению плотных объектов, ее полезно использовать при обработке кусочков кожи и органов, содержащих много мышечной и соединительной ткани.
Ускорения процесса обезвоживания можно добиться, вырезая кусочки тканей меньшего размера (например, 1,0 × 0,5 × 0,2 см), обеспечивая постоянное перемешивание растворов (например, в автоматизированной системе гистологической проводки) и проводя обезвоживание при 37 °C в термостате. Большее повышение температуры растворов не рекомендуется в связи с опасностью сжатия и чрезмерного уплотнения тканей. Плотные объекты (кожа, декальцинированная кость) не следует обезвоживать при повышенной температуре.
Ускорения процесса обезвоживания можно добиться, вырезая кусочки тканей меньшего размера (например, 1,0 × 0,5 × 0,2 см), обеспечивая постоянное перемешивание растворов (например, в автоматизированной системе гистологической проводки) и проводя обезвоживание при 37 °C в термостате. Большее повышение температуры растворов не рекомендуется в связи с опасностью сжатия и чрезмерного уплотнения тканей. Плотные объекты (кожа, декальцинированная кость) не следует обезвоживать при повышенной температуре.
Для обезвоживания маленьких кусочков (размерами до 1,0 × 0,5 × 0,3 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки.
Первая схема:
этанол 80 %-й 6 8 ч;
этанол 96 %-й (I) 12 24 ч;
этанол 96 %-й (II) 4 24 ч;
этанол абсолютный 2 4 ч (при комнатной температуре).
Вторая схема:
этанол 80 %-й 6 8 ч;
этанол 96 %-й (I) 12 24 ч;
этанол 96 %-й (II) 6 24 ч;
этанол 96 %-й (III) 3 5 ч (при комнатной температуре).
Третья схема:
этанол 80 %-й 2 4 ч;
этанол 96 %-й (I) 6 18 ч;
этанол 96 %-й (II) 2 4 ч;
этанол 96 %-й (III) 2 4 ч (при температуре 37 °C).
Высокое качество обезвоживания может быть достигнуто только при использовании этанола соответствующей крепости. Поэтому качество спирта необходимо проверять с помощью ареометра. Абсолютный спирт пригоден для обезвоживания (в качестве абсолютного спирта), если его крепость не ниже 98 %. Объем обезвоживающего раствора должен не менее чем в 10 раз превышать объем погруженных в него обезвоживаемых объектов. Абсолютный этанол можно заменить абсолютированным изопропанолом (99 %). Пригодна для этого и смесь абсолютированного изопропанола и этанола 96 %-го (1: 1).
3.2. Заливка объектов в парафин
Получение тонких срезов образцов исследуемых тканей возможно только после пропитывания последних достаточно плотными средами, какими являются парафин и целлоидин. В настоящее время целлоидин применяется очень редко.
Парафин смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемая при перегонке нефти. Сорта парафина, используемые в качестве среды для гистологической заливки, имеют температуру плавления от 48 до 60 °C. Наиболее удобен в повседневной работе парафин с температурой плавления 52 56 °C. Без дополнительной подготовки технический, пищевой и медицинский парафины не позволяют производить заливку, обеспечивающую высокое качество срезов. В гистологической лаборатории желательно использовать очищенные сорта парафина с добавлением восков или специально разработанные на основе парафина среды с модифицирующими добавками, такие как гистомикс («БиоВитрум», Россия), Paraplast (Sigma, США), Histoplast (Shandon, США).
Пропитку парафином проводят в термостате, обеспечивающем поддержание температуры на 1 2 °C выше температуры плавления используемого парафина (обычно устанавливают температуру 58 °C).
Поскольку расплавленный парафин и этанол не смешиваются, из обезвоженного материала следует удалить спирт (или метилсалицилат, если он был использован для длительного хранения объектов) при помощи промежуточной среды растворителя парафина, смешивающегося с этанолом. В качестве промежуточной среды можно использовать хлороформ, авиационный бензин (рекомендован Р. Лилли, 1969), петролейный эфир, ксилол, бензол, толуол, октан, гексан и др. В практической работе наиболее часто применяют хлороформ и ксилол. Неудовлетворительное качество заливки при использовании хлороформа может быть обусловлено применением хлороформа «для спектроскопии», в который добавлен этанол, разливного хлороформа (при использовании недостаточно просушенных после промывки емкостей) и реактива, долго хранившегося на свету. При доступности абсолютного этанола следует предпочесть менее токсичный петролейный эфир, который лучше удаляет этанол и позволяет достичь более высокого качества пропитки парафином.
Можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки и пропитывания материала.
Заливка в парафин с использованием хлороформа. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:
смесь абсолютного этанола с хлороформом 1: 1 1 2 ч;
хлороформ (I) 1 ч;
хлороформ (II) 1 ч;
хлороформ (III) 1 ч;
хлороформ парафин (1: 1) в термостате при 37 °C 12 24 ч;
парафин (I) в термостате при 56 58 °C 40 60 мин;
парафин (II) в термостате при 56 58 °C 40 60 мин;
смесь абсолютного этанола с хлороформом 1: 1 1 2 ч;
хлороформ (I) 1 ч;
хлороформ (II) 1 ч;
хлороформ (III) 1 ч;
хлороформ парафин (1: 1) в термостате при 37 °C 12 24 ч;
парафин (I) в термостате при 56 58 °C 40 60 мин;
парафин (II) в термостате при 56 58 °C 40 60 мин;
парафин (III) в термостате при 56 58 °C 40 60 мин.
При отсутствии возможности использовать абсолютный этанол первый этап проводки можно пропустить, однако качество пропитки парафином может быть несколько хуже. После обезвоживания с использованием метилсалицилата (или метилбензоата) этот этап следует пропустить. Качество заливки при этом не ухудшится.
Заливка в парафин с использованием петролейного эфира. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:
петролейный эфир (I) 30 60 мин;
петролейный эфир (II) 30 60 мин;
петролейный эфир (III) 30 60 мин;
петролейный эфир-парафин (1:1) в термостате при 37 °C 3 24 ч;
парафин (I) в термостате при 56 58 °C 60 мин;
парафин (II) в термостате при 56 58 °C 60 мин.
Схема проводки материала и заливки в парафин после фиксации объектов в жидкости Буэна, применяемая в отделе общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН.
Перед фиксацией мелкие, тонкие и легко деформирующиеся объекты необходимо поместить на кусочек плотной бумаги. Обезвоженные объекты помещают последовательно в следующие среды:
жидкость Буэна для фиксации 1 сут;
короткая промывка в водопроводной воде 1 15 мин;
этанол 70 %-й 1 сут;
этанол 80 %-й 1 7 сут;
этанол 90 %-й 1 сут;
этанол 96 %-й 1 сут;
абсолютный этанол 1 сут;
абсолютный этанол-хлороформ 1: 1 2 3 ч;
хлороформ (I) 90 мин;
хлороформ (II) 90 мин;
хлороформ-парафин (1: 1) в термостате при 37 °C оставить на ночь (10 15 ч);
парафин (I) в термостате при 56 58 °C 1 ч;
парафин (II) в термостате при 56 58 °C 1 ч;
парафин (III) в термостате при 56 58 °C 1 ч.
Автоматизация процесса замещения промежуточных сред на парафин достигается использованием вакуумных процессоров (например, VIP 6, Sakura), в которых не только происходит автоматическая смена и перемешивание реактивов, но и создаются специальные условия для лучшей пропитки тканей реагентами.
По окончании проводки осуществляется заливка. Объект помещают в бумажную или подогретую в термостате специальную пластиковую (из полипропилена, полистирола и т. п.) или металлическую формочку. Далее в нее наливают свежую порцию разогретого до 58 65 °C парафина. Разогрев заливочного парафина свыше 56 °C рекомендуется в связи с возможностью быстрого застывания парафина, вынутого из термостата, что приводит к неравномерной заливке блока с сохранением пустот. В случае необходимости особой ориентации кусочка ткани при изготовлении срезов можно повернуть материал, обратив плоскость резки ко дну формочки, с помощью подогретых препаровальной иглы и глазного пинцета.