Использование лазерной конфокальной микроскопии для изучения объектов, подвергнутых окраске флуоресцентными красителями, дает возможность определять локализацию специфических молекул и органелл с высокой точностью. Сочетание нескольких красителей и флуоресцентных меток с различными параметрами излучения позволяет проводить двойную, тройную (и более) маркировку с целью обнаружения нескольких молекулярных компонентов в одном образце.
Некоторые низкомолекулярные органические красители проявляют сродство к определенным биомолекулам и клеточным органеллам. Это явление используется для селективной флуоресцентной окраски. Так, например, амилоидные структуры флуоресцируют при взаимодействии с тиофлавинами (Коржевский Д. Э. [и др.], 2013). Флуоресцентный краситель Нильский красный (Nile Red) используется для определения локализации нейтральных липидных включений в клетках. Nile Red имеет яркую флуоресценцию в неполярных средах (максимумы возбуждения/излучения 552/636 нм). Красители BODIPY также используются при окраске нейтральных липидов. Отложения солей кальция в костях, хрящах и минерализованных опухолях при взаимодействии с тетрациклином проявляют желтую флуоресценцию. Для окраски митохондрий клетки инкубируют с красителями Mitotracker, которые пассивно диффундируют через плазматическую мембрану и накапливаются в митохондриях живых клеток. Помимо митохондриальных маркеров синтезированы также красители Lysotracker, выявляющие лизосомы. Краситель DiOC6 применяется для селективного окрашивания эндоплазматической сети. С аналогичной целью используют соединения из группы ER-Tracker.
2.1. Ядерные флуоресцентные красители
Для облегчения идентификации клеток и тканей, а также для определения положения, формы клеток, их апоптозных изменений, фазы митотического цикла в исследованиях, проводимых с применением лазерной конфокальной микроскопии и обычной флуоресцентной микроскопии, используется окраска ядер клеток соответствующими флуоресцентными красителями. Окрашивание ядра клетки значительно облегчает ориентировку в изучаемых препаратах и позволяет регистрировать ряд морфологических параметров, связанных с функциональным состоянием клетки (размеры ядра и ядрышка, состояние хроматина).
При флуоресцентной микроскопии ядерную ДНК, как правило, окрашивают DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндолом). DAPI специфически связывается с ДНК и обладает синей флуоресценцией при возбуждении ультрафиолетовым светом ртутной лампы. При проведении конфокальной микроскопии флуоресценцию DAPI необходимо возбуждать ультрафиолетовым аргоновым лазером (360 нм) или мультифотонным (фемтосекундным пульсирующим) лазером. Диодный лазер (405 нм), которым обычно комплектуются бюджетные варианты конфокальных микроскопов, для этих целей непригоден. В этом случае вместо DAPI используют другие флуоресцентные красители. Их выбор в настоящее время достаточно широк (Приложение 1).
С точки зрения химической организации выделяют четыре основные группы флуоресцентных красителей, применяемых для окрашивания нуклеиновых кислот (НК):
1. Наиболее часто применяются цианиновые (полиметиновые) красители. Они имеют в качестве флуорофорной системы группы СН=, образующие цепь сопряженных двойных связей с электронодонорной и электроноакцепторной группами на концах. Цианиновые красители образованы двумя ароматическими или азотсодержащими гетероциклическими кольцами, соединенными полиметиновой цепью двойных сопряженных углерод-углеродных связей. Выделяют симметричные (полиметиновые красители, содержащие одинаковые гетероциклы на концах полиметиновой цепи) и несимметричные. По количеству метиновых групп различают: цианиновые красители с одной метиновой группой монометинцианины, красители с тремя метиновыми группами триметинцианины (карбоцианины), симметричные цианиновые красители с более длинной цепочкой метиновых групп полиметинцианины (поликарбоцианины). Также существуют мономерные и димерные цианиновые красители.
1. Наиболее часто применяются цианиновые (полиметиновые) красители. Они имеют в качестве флуорофорной системы группы СН=, образующие цепь сопряженных двойных связей с электронодонорной и электроноакцепторной группами на концах. Цианиновые красители образованы двумя ароматическими или азотсодержащими гетероциклическими кольцами, соединенными полиметиновой цепью двойных сопряженных углерод-углеродных связей. Выделяют симметричные (полиметиновые красители, содержащие одинаковые гетероциклы на концах полиметиновой цепи) и несимметричные. По количеству метиновых групп различают: цианиновые красители с одной метиновой группой монометинцианины, красители с тремя метиновыми группами триметинцианины (карбоцианины), симметричные цианиновые красители с более длинной цепочкой метиновых групп полиметинцианины (поликарбоцианины). Также существуют мономерные и димерные цианиновые красители.
2. Фенантридины (этидия бромид, пропидия йодид ).
3. Акридины (акридиновый оранжевый, акридиновый красный, акридиновый желтый).
4. Производные индола и имидазола (Hoechst, DAPI).
В зависимости от механизма взаимодействия с молекулой НК различают три типа флуоресцентных красителей:
интеркалирующие красители, внедряющиеся между парами азотистых оснований. При интеркаляции присутствуют нековалентные межмолекулярные взаимодействия водородные, ван-дер-ваальсовые, электростатические, а также стекинг-взаимодействия между ДНК и интеркалятором (Вардеванян П. О. [и др.], 2010). Пример интеркалирующего красителя пропидия йодид;