В настоящее время разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для них является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95 100 °C, а в отдельных случаях и до 120 °C при повышенном давлении.
5.2. Растворы, применяемые для теплового демаскирования антигенов
С учетом эмпирически установленных особенностей процесса демаскирования в качестве растворов могут быть использованы водные растворы солей различных металлов и буферные растворы при различных pH. Считается, что, помимо гидролиза межмолекулярных связей, образованных благодаря действию фиксаторов, эффективность теплового демаскирования зависит от полноты удаления из срезов ионов кальция. Это достигается введением в буферные растворы солей лимонной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Трилон Б).
Для теплового демаскирования антигенов разработано множество рецептов буферных растворов. В большинстве случаев (если только нет указаний о непригодности этого раствора в аннотации к конкретным антителам) можно применять цитратный буфер (рН = 6,0). По мнению D. J. Dabbs (2006), при отсутствии специального буфера можно использовать дистиллированную воду без добавок. Эффективность демаскирования антигенов в дистиллированной воде ниже, чем при использовании специальных буферных растворов. Наш опыт свидетельствует о том, что при демаскировании антигенов в дистиллированной воде развивается неспецифическое фоновое окрашивание срезов, которое мешает идентификации иммунореактивных структур. Учитывая простоту приготовления цитратного буфера, в общих случаях для демаскирования лучше использовать именно этот раствор.
Как правило, производители первичных антител указывают на необходимость проведения теплового демаскирования для материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин, то отмечают, в каком буфере следует производить демаскирование. Наибольшее распространение получили три буферных раствора, применяемых для демаскирования в том случае, когда оно действительно необходимо. Кроме упомянутого цитратного буфера (рН = 6,0), это EDTA-буфер (pH = 8,0) и Tris-EDTA (pH 10,0). Ряд производителей антител рекомендует для обработки свои оригинальные буферные растворы (например, S-1700 (Dako), CC1 и CC2 (Roche-Ventana), Bulls Eye Decloaker (Biocare) и др.). В отдельных случаях эти растворы позволяют добиться лучшего демаскирующего эффекта, чем обычный цитратный буфер (pH = 6,0). Судя по литературе, среди коммерческих буферных растворов наибольшей популярностью у специалистов пользуется модифицированный цитратный буфер с pH = 6,1 (S-1700, Dako).
Одним из недавних усовершенствований технологии теплового демаскирования антигенов является объединение этого этапа обработки препарата с депарафинированием срезов. При этом используются водные растворы детергентов, а не ксилол и аналогичные органические растворители парафина. При прогреве срезов в водных растворах до температуры, близкой к 100 °C, парафин, имеющий сравнительно низкую температуру плавления, уже расплавлен. Трудность заключается в том, чтобы эффективно удалить расплавленный парафин из среза. Для этого в демаскирующий раствор вводятся детергенты. При обработке таким раствором образуется эмульсия парафина в демаскирующем растворе и, соответственно, происходит депарафинирование среза без применения органических растворителей. Наиболее известным коммерческим буферным раствором для одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов является раствор Trilogy (CellMarque, США). Метод одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов используется в автоматической системе иммуноокрашивания BenchMark (Ventana, США).
Приготовление цитратного буфера. Готовится цитратный буфер (0,01 М, рН = 6,0) следующим образом. Берется 29,4 г цитрата натрия и растворяется в 10 л дистиллированной воды. Затем добавляется 1 н соляная кислота (54 мл). Если pH полученного раствора больше 6, его следует довести до рН = 6, добавляя по каплям 1 % соляную кислоту. Неиспользуемую часть раствора можно хранить в холодильнике в течение недели. Без консерванта раствор нельзя долго хранить.
5.3. Техника теплового демаскирования
Поскольку тепловое демаскирование антигенов требует прогревания срезов в буферных растворах при температуре, близкой к 100 °C, а кипение раствора негативно сказывается на сохранности срезов, были исследованы возможности применения различных приборов для получения высокой температуры без кипения буфера. Оказалось, что для этих целей можно применять водяную баню (95 98 °C), микроволновую печь, пароварку, автоклав, скороварку. В последних двух случаях можно достичь температур выше 100 °C благодаря нагреванию при повышенном давлении. Использование более высоких температур позволяет уменьшить продолжительность процедуры.
5.3. Техника теплового демаскирования
Поскольку тепловое демаскирование антигенов требует прогревания срезов в буферных растворах при температуре, близкой к 100 °C, а кипение раствора негативно сказывается на сохранности срезов, были исследованы возможности применения различных приборов для получения высокой температуры без кипения буфера. Оказалось, что для этих целей можно применять водяную баню (95 98 °C), микроволновую печь, пароварку, автоклав, скороварку. В последних двух случаях можно достичь температур выше 100 °C благодаря нагреванию при повышенном давлении. Использование более высоких температур позволяет уменьшить продолжительность процедуры.
Каждый из предлагавшихся способов разогрева инкубационной среды имеет свои преимущества и недостатки. При использовании водяной бани демаскирование антигенов происходит медленнее всего, поскольку температура раствора поддерживается на уровне 9598 °C, ее удобно контролировать, применяя обычные термометры, и отсутствует необходимость приобретать дорогостоящее оборудование.
В свое время наиболее распространенным способом прогрева препаратов при тепловом демаскировании антигенов было использование микроволновой печи (Kоржевский Д. Э. [и др.], 2005). Вероятно, это связано с не подтвердившимся впоследствии предположением о том, что микроволновое излучение (как физический фактор) само по себе способствует демаскированию.
Одним из наиболее удачных способов прогрева предметных стекол в микроволновой печи является способ E. Jessup (1994). Этот метод позволяет обрабатывать до 10 предметных стекол за один непрерывный цикл работы прибора (30 мин). На дно заполненного высокого пластикового контейнера, вмещающего 600 мл буферного раствора, ставится пластиковый держатель для предметных стекол. Во время прогрева происходит выкипание части раствора, но благодаря высоте исходного уровня жидкости предметные стекла со срезами в течение всего цикла работы прибора полностью омываются буфером. Нет необходимости останавливать инкубацию для пополнения выкипевшего раствора. Тем не менее большинство вариантов обработки препаратов в микроволновой печи предусматривают кипение буфера, что, в свою очередь, негативно сказывается на состоянии срезов, которые при энергичном перемещении жидкости, происходящем при кипении, могут отклеиться от предметного стекла. Применение пароварки наиболее удобный, безопасный и экономически выгодный способ обработки небольших объемов материала. Приборы этого типа более безопасны, чем микроволновая печь и скороварка. Они имеют встроенный таймер, отключающий нагреватель. Температура раствора приближается к 100 °C, но раствор никогда не закипает. При использовании сосуда Хеллендахела, помещаемого в пароварку, одновременно можно обрабатывать до 16 препаратов. Расход буфера сравнительно небольшой (не более 100 мл), что особенно удобно при использовании коммерческих реагентов. Можно использовать и другие сосуды (желательно стаканы из термостойкого стекла). Не рекомендуется ставить в пароварку пластиковые сосуды Коплина и другую пластиковую посуду. Время обработки препаратов в пароварке для различных антигенов составляет от 25 до 45 мин (отсчет времени от момента включения прибора обеспечивает внутренний таймер).
Несмотря на очевидное удобство этого способа, следует заметить, что оптимальное время обработки необходимо выверять для каждого используемого прибора отдельно, поскольку невозможно контролировать время прогрева сосуда с предметными стеклами до рабочей температуры, которое зависит от мощности и устройства конкретного прибора, а также от объема нагреваемой жидкости. Лучшей стандартизации можно добиться, помещая препараты в уже подогретый буфер, однако применение этого подхода делает методику более трудоемкой.
В патологоанатомической практике наибольшее применение находит демаскирование в скороварке (Bancroft J. D. [et al.], 2002). Для работы со скороваркой необходим достаточно большой объем буферного раствора (3 л буфера для скороварки вместимостью 5 л). Такие объемы делают процедуру достаточно дорогостоящей, если только буферный раствор не готовят самостоятельно сотрудники лаборатории.
Предметные стекла в металлическом держателе помещают на дно скороварки, закрывают крышку и начинают нагрев. Время обработки начинают отсчитывать после достижения рабочего давления. Для большинства антигенов оно составляет около 2 мин. Скороварка достаточного объема позволяет одновременно обрабатывать до 25 препаратов.
Следует заметить, что существуют антигены, которые разрушаются при тепловом демаскировании (например, эпитоп ламинина, выявляемый моноклональными мышиными антителами 4С7).
Для срезов, полученных с объектов, фиксированных в коагулирующих фиксаторах и в фиксирующих жидкостях сложного состава, эффект теплового демаскирования не столь очевиден, как для материала, фиксированного в формалине и цинк-формалине. В отдельных случаях использование высокочувствительных систем детекции позволяет обойтись без теплового демаскирования и получить результаты высокого качества с меньшими временными затратами. Если есть подозрение, что фиксация объектов производилась не в оптимальном режиме (длительная фиксация в растворе формалина, приготовленного «на глаз», и т. п.), обязательно тепловое демаскирование.
Эффективность процедуры теплового демаскирования антигенов удобно контролировать, параллельно с изучаемой серией предметных стекол производя обработку положительного контроля, в котором имеются пролиферирующие клетки (любой лимфатический узел и т. п.). После демаскирования на этом препарате необходимо поставить реакцию, выявляющую пролиферативный маркер антиген Ki-67. Для его определения следует использовать моноклональные антитела MIB-1 (ткани человека) и MIB-5 (ткани крысы). В случае, когда демаскировка антигенов проведена неправильно, пролиферативные маркеры в положительном контроле не будут обнаружены. Наш опыт показывает, что для оценки эффективности демаскирования подходящим антигеном является виментин (Кирик О. В. [и др.], 2012). Особенно удобно использовать при этом моноклональные мышиные антитела клона V9 и учитывать эффективность демаскирования виментина в составе эндотелия мелких кровеносных сосудов и капилляров. Удобство этой реакции обусловлено в первую очередь тем, что кровеносные сосуды присутствуют в большинстве подвергаемых иммуноцитохимическому исследованию объектов. Таким образом, эндотелий кровеносных сосудов будет выполнять функцию внутреннего положительного индикатора, подтверждающего эффективность теплового демаскирования.