2 Синтез РНК-затравки ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой.
3 Синтез комплементарных цепей ДНК-полимеразой (II, III). Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения дезоксинуклеотидов к 3'-концу растущей цепи, то есть в направлении от 5' к 3'-концу вдоль матричной цепи. Синтеза цепей в обратном направлении не происходит. Поэтому синтезируемые цепи в репликативной вилке растут в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно это ведущая, или лидирующая цепь. Синтез другой цепи идет импульсами это отстающая цепь. Лидирующая цепь синтезируется в направлении роста репликативной вилки, отстающая в обратном направлении в результате нескольких актов инициации. В итоге образуется несколько коротких цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи. Механизм репликации лидирующей и отстающей цепей в принципе одинаков и требует синтеза коротких РНК-затравок, комплементарных матричной цепи. Скорость копирования в репликативной вилке постоянна и равна 1,5 т.п.н./с.
4 Дезинтеграция РНК-затравки РНКазой Н.
5 Сшивание фрагментов Оказаки ДНК-лигазой.
6 Снятие сверхспирализации топоизомеразами (топоизомераза I вносит разрывы в одну цепь, топоизомераза II вносит разрывы в обе цепи).
Терминация синтеза.
1 Терминация синтеза и расхождение кольцевых геномов упрощены, поскольку синтез цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3' и 5'-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой.
2 В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3'-концом и пробелом на 5'-конце. Предложено 2 способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи (рисунок 7).
В 1972 г. Уотсон предложил модель завершения репликации ДНК с прямыми повторами на концах через образование конкатемеров, которые представляют собой несколько тандемно-повторяющихся единиц генома. После образования конкатемера специфическая эндонуклеаза вносит ступенчатый разрыв в месте воссоединения. Это приводит к образованию выступающих 5'-концов и пробелов на 3'-конце, которые наращиваются ДНК-полимеразой. Бреши закрываются или путем репарации или лигирования.
Синтез полноразмерных линейных ДНК с инвертированными повторами на концах может быть завершен через образование шпильки. Инвертированные повторы это две копии одной и той же последовательности ДНК в составе одной молекулы, находящиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу инвертированные повторы образуют палиндромы. На рисунке 7 показано, что терминация 3'-конца через образование шпильки включает лигирование 3'-конца шпильки с 5'-концом комплементарной цепи, внесение одноцепочечного разрыва с образованием выступающего 3'-конца и его удлинение.
а через образование конкатемеров; б через образование шпильки.
Рисунок 7 Схемы терминации синтеза линейных ДНК
3.7.1.2 Основные принципы и механизмы репликации РНК-геномов
РНК-содержащие вирусы единственные известные создания природы, использующие РНК в качестве генетического материала. Чтобы осуществить экспрессию, репликацию и перенос генов, различные семейства РНК-содержащих вирусов развили разнообразные генетические стратегии и жизненные циклы, которые эксплуатируют биологию и биохимию их хозяев многими различными способами. Эти вирусы копируют свои геномы с использованием одного из двух уникальных биохимических путей: или путем РНК-зависимого синтеза РНК (репликация РНК) или, как ретровирусы, РНК-зависимого синтеза ДНК (обратная транскрипция), который сопровождается репликацией ДНК и транскрипцией. Эти пути требуют работы ферментов, которые обычно отсутствуют в неинфицированных клетках-хозяевах. В связи с этим, данные ферменты должны быть генетически детерминированы вирусом и экспрессированы в течение инфекции. В некоторых семействах РНК-содержащих вирусов эти уникальные синтетические процессы необходимы на первых стадиях инфекционного цикла, что требует наличия упакованных в вирион полимеразы и других ферментов, необходимых для осуществления следующего цикла инфекции.
Внутриклеточные места репликации РНК-геномов вирусов. Основная масса РНК-содержащих вирусов реплицируется в цитоплазме. Однако известен ряд исключений из этого правила. В дополнение к ретровирусам, которые синтезируют ДНК копии своих геномов и встраивают их в клеточные хромосомы, ортомиксо- и борнавирусы, чей геном представлен линейной (-)РНК, и кольцевая РНК вируса гепатита дельта, подобная вироидам растений, также реплицируются в ядре. Каждый компартмент клетки имеет свои возможности и резервы, определяемые доступностью клеточных компонентов и биохимических путей, которые могут быть использованы и скоординированы вирусами.
Внутриклеточные места репликации РНК-геномов вирусов. Основная масса РНК-содержащих вирусов реплицируется в цитоплазме. Однако известен ряд исключений из этого правила. В дополнение к ретровирусам, которые синтезируют ДНК копии своих геномов и встраивают их в клеточные хромосомы, ортомиксо- и борнавирусы, чей геном представлен линейной (-)РНК, и кольцевая РНК вируса гепатита дельта, подобная вироидам растений, также реплицируются в ядре. Каждый компартмент клетки имеет свои возможности и резервы, определяемые доступностью клеточных компонентов и биохимических путей, которые могут быть использованы и скоординированы вирусами.
Уровни сегментации: гены, мРНК и белки. Разделение эукариотических клеток на ядерные и эндоплазматические компартменты глубоко влияет на биологию вирусов. Рибосомы эукариот требуют метилированной кэп-структуры на 5-конце мРНК, которая играет критическую роль в передаче сигналов инициирования белкового синтеза. В результате, эукариоты подчиняются правилу «одна мРНК одна полипептидная цепь», и, за немногими исключениями, каждая мРНК функционирует как отдельная единица трансляции. РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов обладают ограниченной способностью к взаимодействию с внутренними инициирующими сайтами РНК-матриц, что создает проблему получения нескольких индивидуальных белков на основе единственного генома. В процессе эволюции различные семейства РНК-содержащих вирусов нашли три решения этой проблемы: фрагментация на уровне белков, образование субгеномных мРНК, сегментация генома. Например, РНК-вирусы семейств Picorna-, Toga-, Flavi и Retroviridae для того, чтобы получить функциональные белковые продукты используют протеолитическое расщепление полипротеина-предшественника. Вирусы других семейств Сorona-, Аrteri-, Rhabdo-, Paramyxoviridae зависят от сложных механизмов транскрипции и чтобы произвести несколько различных моноцистронных мРНК с единственной РНК- матрицы вынуждены синтезировать субгеномные мРНК. Представители семейств Reo-, Orthomyxo-, Bunya-, Arenaviridae и др. решили проблему, фрагментируя геномы. При этом вирионы содержат многократные доли генома, каждый из которых часто представлен единственным геном. У вирусов растений такие доли РНК генома могут пакетироваться в отдельные вирионы (явление мультипартитности), требуя инфекции несколькими вирусными частицами для обеспечения инвазивной способности вируса, в то время, как сегменты генома вирусов животных обычно пакетированы совместно. Напротив, ДНК вирусы редко используют или сегментацию генома или синтез полипротеина. Это вероятно связано с относительной простотой синтеза моноцистронных мРНК, которая может быть транскрибирована с внутренних промоторов на двунитевой ДНК и подвергнута альтернативному сплайсингу, подобно ядерным транскриптам клетки.
Каждая разновидность РНК-генома имеет свои стратегии репликации, экспрессии генов и упаковки в вирионы.
Одно- и двунитевые РНК-геномы вирусов. Хотя все РНК-геномы реплицируются обычным способом комплементарного спаривания нуклеотидных оснований матрицы и дочерней нити, различные семейства РНК-содержащих вирусов реализуют различные молекулярные стратегии репликативного цикла РНК и ее инкапсидации. Семейства однонитевых РНК-вирусов превосходят численностью семейства вирусов с двунитевой РНК геномом почти в 10 раз.
Чтобы ограничить накопление промежуточных репликативных форм, содержащих области двунитевых РНК, вирусы разработали стратегии, различающиеся у (+)РНК и (-)РНК. Все (+)РНК-содержащие вирусы синтезируют непропорционально низкие уровни негативных нитей от 1 % до 5 % от уровня положительной РНК и таким образом минимизируют потенциал для накопления двунитевой РНК. Наоборот, (-)РНК-вирусы нуждаются в существенных количествах (+)РНК нитей, чтобы использовать их в качестве матрицы для синтеза геномного потомства. Обычно ()РНК-вирусы предотвращают отжиг (+) и (-) нитей, сохраняя геномную РНК в составе нуклеокапсида.
(+)РНК и (-)РНК геномы. Различия между положительным и отрицательным РНК-геномами определяются полярностью нитей, инкапсидированных в вирионы. (+)РНК-геном в начале инфекции использует синтезированные на рибосомах вирусоспецифические белки и клеточные РНК-связывающие белки. После того, как синтезированные вирусоспецифическая РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) и другие неструктурные белки покидают рибосомы, начинается репликация РНК. Затем вновь синтезированные структурные белки вириона и РНК ассемблируют с образованием вирусного потомства. В противовес этому, (-)РНК-геномы и их антигеномные комплементы остаются связанными с белками нуклеокапсида, как в пределах вирусных частиц, так и в течение всего цикла вирусной репликации. Эти фундаментальные адаптационные различия основаны на том, что геномы положительной полярности должны удовлетворять трансляционным критериям, которые диктуются клеткой-хозяином, в то время как негативные геномы и антигеномы должны удовлетворять только матричным требованиям вирусоспецифической RdRp, в связи с тем, что они копируются, но никогда не транслируются. Хотя до настоящего времени остается неясным, как полимераза может копировать покрытые белком РНК-матрицы. днРНК-геномы являются промежуточными между этими крайностями: родительские доли генома остаются изолированными в субвирусных частицах на протяжении всего инфекционного цикла.
Однако следует учитывать, что положительные нити-предшественники двунитевого РНК потомства изначально не инкапсидированы. Вероятно, эти вариации отражают существенные различия в структурах вирусных комплексов RdRp-матрицах и в молекулярных механизмах репликации положительных, отрицательных и двунитевых РНК-геномов.