Интеграция вирусного генома в геном хозяина может происходить несколькими путями:
a) интеграция с использованием сайт-специфической рекомбинации. В общем смысле рекомбинация это взаимодействие между специфическими участками ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация взаимодействие между специфическими парами последовательностей, в пределах которых имеются гомологичные последовательности. Это консервативная рекомбинация. Например, при интеграции ДНК фага λ в рекомбинации участвуют два совершенно определенных участка вирусного и хозяйского геномов attP и attB, соответственно. Эти участки имеют одинаковые сердцевины, но разные «плечи». Соответственно, фаговая последовательность обозначается как POP', клеточная ВОВ'. В результате интеграции образуется участок ВОР'-РОВ'. Для осуществления интеграции необходима интеграза (топоизомераза I) и клеточный белок IHF (клеточный фактор интеграции). Интегрированный вирусный геном существует в виде профага и может выщепляться с участием вирусоспецифического белка;
б) интеграция и репликация в процессе репликативной транспозиции. Транспозон последовательность ДНК, способная реплицироваться и внедрять одну из копий в новое место генома.
Явление репликативной транспозиции установлено для транспозирующего фага Mu. Геном фага линейная днДНК, размером 30 т.п.н., имеет на концах клеточные, а не вирусные нуклеотидные последовательности, то есть всегда находится в состоянии профага. После попадания вируса в клетку, ДНК приобретает форму, близкую кольцевой, сближая концы. Вирус-специфический белок вносит однонитевые разрывы как в клеточные последовательности фаговой ДНК, так и в ДНК клетки-хозяина. Разрывы могут происходить практически в любом месте ДНК. Выступающие 5'-концы клеточной ДНК ковалентно соединяются с 3'-концами вирусной ДНК. Лишние концы удаляются, бреши репарируются и фаговый геном оказывается встроенным в геном клетки хозяина. Особенностью репликации фага Mu является то, что она идет без выщепления профага. Копии ДНК, образуемые в процессе репликации, эффективно внедряются в новые места ДНК хозяина.
3.7.2 Транскрипция
Транскрипция первая стадия реализации генетической информации, на которой последовательность геномной нуклеиновой кислоты копируется в виде нуклеотидной последовательности мРНК. В основе механизма копирования лежит тот же структурный принцип комплементарного спаривания оснований, что и при матричном синтезе.
3.7.2.1 Основные принципы и механизмы транскрипции у вирусов
Транскрипция осуществляется ферментами РНК-полимеразами. В транскрипции ДНК-геномов вирусов принимает участие ДНК-зависимая РНК-полимераза II, в редких случаях РНК-полимераза III. В транскрипции РНК-геномов участвует уникальный вирусный фермент РНК-зависимая РНК-полимераза.
Большинство ядерных ДНК-содержащих вирусов используют для транскрипции клеточную РНК-полимеразу II. Поксвирусы (цитоплазматические ДНК-содержащие вирусы) содержат свою ДНК-зависимую РНК-полимеразу, имеющую, тем не менее, сходство с РНК-полимеразой II. Часто вирусы бактерий для ранней транскрипции своих генов используют клеточную РНК-полимеразу II, а для поздней собственную вновь синтезированную транскриптазу. В то же время, этот фермент может входить и в состав вириона.
В 1970 г. Балтимор с соавторами продемонстрировали наличие в составе вириона вируса везикулярного стоматита РНК-зависимой РНК-полимеразы. Позже этот фермент был найден у арена-, бунья-, орто- и парамиксо-, реовирусов, то есть у вирусов с (-)РНК и днРНК-геномом. У (+)РНК-содержащих вирусов РНК-полимераза детерминирована геномом. РНК-зависимые РНК-полимеразы обладают как транскриптазной, так и репликазной активностью.
Общие принципы транскрипции геномов вирусов сходны с таковыми для клеток про- и эукариот. Индивидуальные особенности проявляются на стадиях посттранскрипционного процессинга (созревания) мРНК и регуляции транскрипции. Синтез молекул РНК начинается в определенном месте матрицы, называемом промотором и заканчивается в определенном месте, называемом терминатором. Участок ДНК, ограниченный промотором и терминатором, представляет собой единицу транскрипции транскриптон. В пределах транскриптона копируется только одна цепь, которую называют значащей или матричной. У эукариот в состав транскриптона входит один ген. Транскриптон прокариот содержит несколько генов, его чаще называют оперон. Транскрипционный цикл включает несколько стадий: связывание транскриптазы с матричной цепью, инициацию цепи РНК, элонгацию, терминацию и посттранскрипционный процессинг. Процессинг может включать кэпирование 5'конца, метилирование гуанидина, полиаденилирование 3'-конца, сплайсинг. При рассмотрении принципов транскрипции следует различать первичную транскрипцию (синтез на геномной матрице) и вторичную транскрипцию (синтез на вновь синтезированной матрице).
Многообразие видов вирусных геномов определяет существование различных подходов к синтезу вирусных мРНК в клетке хозяина. Однако все эти подходы могут быть суммированы в единой схеме стратегии синтеза мРНК (рисунок 15).
Рисунок 15 Стратегия транскрипции геномов вирусов
3.7.2.2 Особенности транскрипции РНК-геномов вирусов
Независимо от структуры и стратегии репликации геномов, все вирусы должны экспрессировать гены на ранних этапах инфекции в виде функциональных мРНК, чтобы использовать трансляционный аппарат клетки для синтеза вирусных белков. Исходя из этого различные генетические стратегии, используемые РНК-вирусами, сосредоточены вокруг вирусных мРНК, которые определены, как ключевая структура в этих процессах. Транскрипция РНК-геномов вирусов осуществляется тем же ферментом, что и репликация вирусоспецифической RdRp, которая также является транскриптазой. У РНК-содержащих вирусов репликация и транскрипция процессы взаимосвязанные и часто их трудно разделить.
1 (+)РНК-геномы. Геномная (+)РНК это мРНК, то есть геномная нуклеотидная последовательность соответствует последовательности мРНК. Для осуществления процесса транскрипции вирусам с таким геномом необходимо синтезировать минус-нить с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая чаще детерминирована вирусным геномом и транслируется непосредственно с геномной РНК. Вирусные (+)РНК-геномы не всегда кодируют полную РНК-полимеразу, возможно детерминирование только одной из субъединиц, которая затем ассоциирует с клеточными белками (фаг Qβ, некоторые вирусы растений).
1 (+)РНК-геномы. Геномная (+)РНК это мРНК, то есть геномная нуклеотидная последовательность соответствует последовательности мРНК. Для осуществления процесса транскрипции вирусам с таким геномом необходимо синтезировать минус-нить с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, которая чаще детерминирована вирусным геномом и транслируется непосредственно с геномной РНК. Вирусные (+)РНК-геномы не всегда кодируют полную РНК-полимеразу, возможно детерминирование только одной из субъединиц, которая затем ассоциирует с клеточными белками (фаг Qβ, некоторые вирусы растений).
Транскрипция (+)РНК-геномов может протекать двумя путями:
а) с образованием субгеномных мРНК (необходимы для синтеза ранних белков);
б) без образования субгеномных мРНК. В этом случае транскрипция будет являться также и репликацией.
Субгеномные (+)РНК, так же, как и геномные, считываются с полноразмерной минус-нити. Это может происходить двумя способами.
В одном случае образуются субгеномные РНК (один или несколько видов), которые имеют 3'-концы, идентичные 3'-концу полноразмерной плюс-нити, но имеют разные 5'-последовательности. Это связано с тем, что минус-нити РНК имеют участки, подобные промоторам. РНК-полимераза узнает эти участки, связывается с ними и может начинать синтез РНК с них, а не только с 3'-конца. Таким способом образуются субгеномные РНК у альфавирусов и ряда вирусов растений, в том числе у ВТМ.
Другой вариант образования субгеномных РНК реализуется у коронавирусов. В зараженной клетке обнаруживаются 6 классов субгеномных РНК. Нуклеотидные последовательности этих РНК идентичны (+)РНК не только по 3'-, но и по 5'-концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.
концам. Объясняется это тем, что синтез всех плюс-нитей начинается на 3'-конце антигенома с синтеза так называемой лидерной последовательности (-70 нуклеотидов). Этот «лидер» обладает слабой связью с матрицей и может отсоединяться от нее, а затем присоединяться к другому участку в последовательности антигенома. Минус-матрица содержит 6 участков, комплементарных лидерной последовательности, что и определяет существование 6 классов субгеномных РНК.
2 (-)РНК-геномы. Геномная (-)РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна мРНК, является матрицей для транскрипции и для репликации. Оба эти процесса протекают на матрице, находящейся в составе РНП, при участии вирионной РНК-полимеразы. Синтезируемые мРНК моноцистронны, так как все вирусы с (-)РНК геномом поражают только эукариот. (-)РНК геномы могут быть непрерывны, а могут быть сегментированы.
Механизм образования моноцистронных мРНК на матрице непрерывного ()РНК-генома до конца не установлен. Наиболее вероятной является модель, установленная для вируса везикулярного стоматита, согласно которой на границах между участками (-)РНК, кодирующими индивидуальные белки, располагаются специальные сигналы, терминирующие и реинициирующие цепи (+)РНК. Каждый такой участок, если идти от 3' к 5'-концу, заканчивается 7-ю остатками уридиловой кислоты. На этом участке РНК-полимераза как бы пробуксовывает, синтезируя поли-А последовательность, состоящую из нескольких десятков адениловой кислоты. 5'концы молекул мРНК кэпируются, по всей вероятности, при участии вирусоспецифических ферментов.
Несколько иначе протекает транскрипция сегментированных (-)РНК геномов. Рассмотрим транскрипцию генома вируса гриппа, который представлен 8-ю сегментами (-)РНК. Транскрипция протекает в ядре в составе РНП. В качестве затравки для РНК-полимеразы используются фрагменты транскриптов клеточных мРНК. Вирусоспецифический белок (P-белок) узнает кэпированные 5'-концы этих транскриптов и фиксирует их на 3-конце геномных РНК. Затем этот же или другой белок вносит одноцепочечный разрыв на расстоянии 10-13 нуклеотидов от его 5'-конца. Возникающий при этом короткий кэпированный клеточный олигонуклеотид и является затравкой для синтеза вирусоспецифических мРНК. Поли-А последовательность на 3'-конце образуется за счет пробуксовывания полимеразы так же, как и у вируса везикулярного стоматита. Однако на этом особенности транскрипции генов вируса гриппа не заканчиваются. Два геномных сегмента вируса гриппа являются матрицей для синтеза четырех молекул мРНК, так как имеют альтернативные открытые рамки считывания, подобно ДНК-геномам. Два дополнительных вида мРНК образуются путем сплайсинга, осуществляемого клеточными ферментами по обычному механизму.