Мысли о противоопухолевых свойствах ГСК высказываются более 50 лет, однако механизмы этого явления неясны. Показана способность ГСК подавлять процессы роста клеток рака поджелудочной, предстательной желез и ряда некоторых линий меланомы, клеток первичного лейкоза, саркомы Капоши, гепатомы и рака молочной железы. В качестве механизмов этого феномена указывается подавление CD34
+
Важной особенностью процесса коммуникации ГСК с клетками опухолей является перенос флуоресцентной метки между ними. В настоящей работе использовались красители на основе сукцинимидного эфира 5,6-карбоксилфлуоресцеин диацетата, обладающего липофильными свойствами, благодаря чему они легко проникают сквозь клеточную мембрану в процессе окрашивания. В цитоплазме клетки молекула красителя ковалентно взаимодействует с аминогруппами цитоплазматических белков (Rahman et al., 2015), благодаря чему метка не высвобождается из клеток и приобретает способность флуоресцировать. Это позволяет рассматривать сущность выявленного в настоящем фрагменте работы феномена переноса флуоресцентной метки именно как трансфер цитоплазматических белков, неразрывно связанных с клеточным красителем. При этом транспорт белков происходит преимущественно между ГСК и опухолевыми клетками разных линий, что, очевидно, представляет собой закономерность межклеточного взаимодействия в данной системе.
Особый интерес представляют механизмы данного явления. Существуют данные о возможности клеточной фузии, или слияния стволовой и неопластической клеток (Чумасов и др., 2010). Этот механизм играет важную роль в регуляции стволовыми клетками процессов детерминации, индукции и дифференциации, коррекции нарушений в поврежденных клетках, репарации и регуляции фенотипа стволовых клеток костного мозга (Wurmser et al., 2002).
Обмен флуоресцентной меткой возможен через экзосомы (Xu et al., 2015), в пользу чего свидетельствует наличие большого количества флуоресцирующих объектов мелкого размера существенно меньше диаметра ГСК. Обмен экстрацеллюлярными везикулами с белками и микроРНК возможен также через особые дифференцировки цитоплазмы наноразмерные микротрубки (Godlewski et al., 2015), образуемые между мембранами взаимодействующих клеток, либо путем формирования структурно-функционального синцития между стволовыми и опухолевыми клетками.
В ходе эксперимента при взаимодействии стволовых и опухолевых клеток мы наблюдали рад принципиальных моментов. Так, способность ГСК к подавлению ключевых функций опухолевых клеток носит дозозависимый характер, что в известном смысле объясняет конечный биологический смысл их миграции в опухолевую ткань. Резонно предположить, что существенная разница между количеством СК в молодом и пожилом возрасте является одной из причин преобладания злокачественных опухолей во 2-й половине жизни.
При сокультивировании ГСК и опухолевых клеток различных типов в соотношении 1:1 становится возможным описать другие принципиальные закономерности. Клетки рака легкого преимущественно накапливают флуоресцентную метку (цитоплазму), привнесенную из ГСК, что, вероятно, является одним из механизмов противоопухолевого действия этого типа клеток. Во втором случае при культивировании ГСК с клетками линии U-87 и MCF-7 наблюдается увеличение количества дважды позитивных клеток при снижении количества ГСК. При этом важно, что к 96 ч наблюдений в сокультуре ГСК с клетками глиобластомы практически не остается стволовых клеток, позитивных только в отношении одного из используемых красителей.
Механизмы данного феномена нуждаются в дальнейшем изучении, однако, исходя из данных эксперимента, нельзя исключить, что специфика наблюдаемых феноменов отражает именно принципиальное существо взаимодействия между клетками данного типа. Так, направленная миграция ГСК к клеткам глиобластомы резко усиливается при активизации различного типа рецепторов лигандами, продуцируемыми как зоной повреждения, так и самими опухолевыми клетками. В ответ на эти стимулы ГСК мигрируют к опухолевым клеткам и адгезируют к ним. Безусловно, это явление носит регуляторный характер, но в процессе взаимодействия с неопластическими клетками ГСК подвергаются воздействию различных протеолитических ферментов, продуцируемых клетками опухоли. С одной стороны, такое воздействие запускает в них процессы апоптоза, что проявляется накоплением в цитоплазме соответствующих белков, с другой позволяет опухолевым клеткам фагоцитировать фрагменты разрушенных клеток. Весьма вероятно, что накопление в опухолевых клетках проапоптотических и других белков вызывает серьезные сдвиги в эпигенетической регуляции экспрессии генов, что ведет к торможению пролиферации и угнетению жизненных функций опухолевых клеток. Именно при следовании этой логике становится понятным наблюдаемый нами дозозависимый противоопухолевый эффект ГСК.
Таким образом, при совместном культивировании гемопоэтические CD34
+
Глава 5. Фундаментальные аспекты проблемы: взаимодействие гемопоэтических стволовых и опухолевых клеток на модели глиобластомы in vivo (соавт. д.м. н. И.С. Брюховецкий,
м.н. с. С.В. Зайцев)
Последние 10 лет наша исследовательская группа занималась серьезными фундаментальными научными исследованиями в области изучения межклеточного взаимодействия стволовых клеток (СК) и различных типов опухолевых клеток (ОК) и опухолевых СК (ОСК) не только in vitro, но и in vivo (Брюховецкий А. С., 20032016; Брюховецкий И. С. и др., 20102016; Bryukhovetskiy A.S. et al., 20132016; Bryukhovetskiy I.S. et al., 20102016). Работа была выполнена как на частные пожертвования, так и при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (соглашения 14.575.21.0038 (RFMEF157514X0038), 14.584.21.0027 (RFMEFI58417X0027)), Российского научного фонда (проект 14-15-00084), Российского фонда фундаментальных исследований (проект 19-315-90077). В соответствии с поставленной задачей исследование включало 3 этапа работ:
1) моделирование глиобластомы in vivo;
2) изучение феномена направленной миграции гемопоэтических стволовых клеток в опухолевый очаг;
3) изучение закономерностей процесса межклеточного взаимодействия в опухолевом очаге.
Создание экспериментальной модели глиобластомы in vivo
Прежде чем приступить к непосредственному описанию экспериментов, считаем необходимым сделать важную ремарку по поводу дизайна работы. Абсолютное большинство работ по изучению взаимодействия и взаимовлияния нормальных стволовых и опухолевых клеток in vivo выполнены с использованием особого типа экспериментальных животных, а именно иммунодефицитных крыс и мышей. Признавая методологическую обоснованность таких исследований, не можем не подчеркнуть, что разрыв между научной значимостью и практической ценностью таких данных весьма велик. В этой связи при планировании эксперимента мы отказались от использования иммунодефицитных животных, выбрав в качестве объекта исследования половозрелых крыс породы вистар возрастом 1012 нед., массой 200220 г.
Использование одобрено Этическим комитетом Школы биомедицины ДВФУ (протоколы 1 и 2 от 05.03.2017). Животных содержали в условиях, соответствующих стандартам GLP и Хельсинкской декларации WMA об этических принципах лечения животных в экспериментах. Исследование проводилось в соответствии с требованиями законодательства Великобритании (U.K. Animals Scientific Procedures), Директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных и руководством Национального института здравоохранения США по уходу и использованию лабораторных животных. Все исследования на животных соответствовали рекомендациям ARRIVE и рекомендациям AVMA 2013 г. по эвтаназии экспериментальных животных.
Для моделирования низкодифференцированной злокачественной опухоли головного мозга использованы клетки глиомы линии С6 (ATCC® CCL-107). Клетки использованы в эксперименте после 3-го пассажа с момента разморозки. Перед началом эксперимента все клетки протестированы на контаминацию микоплазмой с помощью Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC® 301012K). Для определения фенотипа опухолевых клеток выполняли предварительную иммуноцитохимическую характеристику. Антителами к нестину окрашивались 87,6 ± 12,1% клеток, к белку p53 82,3 ± 9,8%. Число клеток линии С6, позитивных в отношении к белкам CD133 (3,7 ± 2,8), S100 (7,4 ± 4,3%), глиального фибриллярного кислого белка GFAP (7,2 ± 2,2%) и βIII-тубулина (9,3 ± 4,4%), было невелико (рис. 22).
Животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 2 мг раствора, содержащего Zoletil 100 (Virbac, Франция) + Rometar (Bioveta a.s. Czech) в соотношении 1:4. Выполняли разрез кожи головы и накладывали фрезевое отверстие, используя Ideal Micro Drill (Harvard apparatus, US); 0,2×10
6
Имплантация опухолевых клеток в мозг половозрелых крыс породы вистар приводила к быстрому формированию опухолей, хорошо визуализируемых при МРТ-обследовании головного мозга, у оперированных животных спустя 7 сут. с момента имплантации (рис. 23). К 20-му дню эксперимента опухоль была хорошо заметна на препаратах головного мозга крыс. При анализе морфологических изменений обращали на себя внимание гиперемия сосудов мозга в месте расположения опухоли, набухание и отечность мозгового вещества, наличие на поверхности мозга рельефных вдавлений от костей черепа, сглаженность основных борозд и извилин.
Как правило, опухоль занимала больше половины полушария мозга, возвышалась над его конвекситальной поверхностью и была представлена на срезах мозга светло-красной или пестрой опалесцирующей тканью, контрастной цвету основных церебральных структур (рис. 24 АВ).
Рис. 22.⠀Иммуноцитохимическая характеристика клеток линии С6, использованных для экспериментального моделирования глиобластомы in vivo. Иммуногистохимическая реакция: А на нестин, Б p53; В CD133; Г tubulin-βIII; Д S100, Е GFAP. Ж, З контрольное окрашивание вторичными антителами: Ж Alexa 488; З Alexa 633. Специфическая флуоресценция отсутствует. Ядра докрашены DAPI
При гистологическом исследовании неопластическая ткань была представлена клетками разнообразной формы с различным количеством ядер (рис. 24 А, Б).
Рис. 23.⠀Опухоль в мозге крысы, 20 сут. после введения клеток. А макропрепарат, опухоль возвышается над поверхностью полушария; Б фронтальный срез головного мозга, признаки сдавления опухолью мозговых структур; В магнитно-резонансная томограмма мозга крысы, 20 сут. эксперимента, режим N2 Turbo RARE
Рис. 24.⠀Опухоль в головном мозге крыс. А, Б 14 сут. с момента имплантации (Б масштаб 200 мкм); В, Г 20 сут., опухолевая ткань с новообразованными кровеносными сосудами; Д формирование кровеносного сосуда среди клеток сателлитного очага; Е 30 сут., ангиоцентрическая группировка опухолевых клеток и зоны некроза в опухолевой ткани. Окраска гематоксилин-эозином
К 14-му дню опухоль содержала множество микрососудов, что свидетельствовало о высокой скорости метаболических процессов. Очевидно, хорошая васкуляризация интенсифицировала метаболизм клеток глиомы, которые, формируя вихревые очертания вокруг новообразованных сосудов, вторгались в дистрофически измененную паренхиму мозга, где формировали длинные клеточные тяжи, окруженные большим количеством солитарных клеток глиомы, инфильтрирующих мозговое вещество. На некотором удалении от первичного неопластического узла клетки глиомы уплотнялись и образовывали конгломераты, из которых возникали сателлитные очаги. В центре такого очага быстро формировался питающий кровеносный сосуд, что значительно интенсифицировало процессы неопластического роста и инвазии. С появлением в кровеносном сосуде признаков эластической мембраны обнаруживалась тенденция к слиянию сателлитного очага с первичной опухолью. При этом клетки опухоли уплотнялись вокруг кровеносного сосуда, что формировало характерную картину «псевдорозеол» (5 Е).
С 28-го дня наблюдения в глубоких отделах опухолевой ткани начинались процессы гибели неопластических клеток, что указывало на принципиальную неспособность кровеносной сети обеспечить потребности быстро растущей клеточной массы опухоли. С этого времени в опухолевой ткани появлялись зоны разрежения, большая часть опухолевых клеток концентрировалась вокруг питающего кровеносного сосуда, обнаруживая характерную картину розеол или «псевдорозеол» на фоне участков некроза, занимающих основное место в морфологической картине, окруженных псевдопалисадными структурами (рис. 25).
Таким образом, имплантация 0,2 × 10
6
Анализ миграции гемопоэтических стволовых клеток в опухолевый очаг
Для решения конкретной задачи, а именно изучения закономерностей миграции нормальных ГСК в неопластический очаг, был использован биомедицинский препарат гемопоэтических стволовых клеток, предоставленный АО Клинический госпиталь «НейроВита» (г. Москва). По данным сопроводительной документации, препарат был представлен лейкоконцентратом мононуклеарных CD45
+
+
Рис. 25.⠀Микропрепарат мозга крысы с перевитой глиомой С6. Окраска гематоксиллин-эозином, 28 сут. эксперимента. АГ некротические области в центре опухолевого узла (1), новообразованные кровеносные сосуды в окружении плотно сгруппированных опухолевых клеток, формирующих псевдопалисадные структуры (2), а также множество запустевших новообразованных кровеносных сосудов в центре некротических областей (3); Д множественные неопластические клетки, инфильтрирующие ткань мозга; E участки инвазии по типу «языков пламени»
На протяжении 1 нед. перед проведением эксперимента животным была проведена иммуносупрессивная терапия (бусульфан Sigma-Aldrich, кат. BP403), дексаметазон (Sigma-Aldrich, кат. D1159), циклофосфамид (Sigma-Aldrich, кат. BP1094)). За 2 ч до введения животным ГСК были окрашены флуоресцентными трейсерами Red CMTPX Dye (C34552, Molecular Probes; спектр возбуждения / эмиссии 577/602 нм) или Vybrant® CFDA SE (V12883, Molecular Probes; спектр возбуждения / эмиссии 492/517 нм) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Эти клетки в количестве 0,5 × 10
6
У животных экспериментальной группы появление единичных флуоресцирующих объектов в зоне расположения опухолевой ткани наблюдалось уже через 3 дня после введения клеток. В этот период местом их предпочтительной локализации является граница между опухолью и здоровой тканью мозга. Появление флуоресцирующих объектов в более глубоких зонах опухоли регистрируется в связи с проходящими здесь кровеносными сосудами (рис. 26 А, указано стрелками).
Рис. 26.⠀Распределение меченных Vybrant® CFDA SE гемопоэтических стволовых клеток в мозге животных с привитой глиобластомой на 3-е (А) и 5-е (БГ) сутки после введения. А на ранних сроках клетки локализуются вдоль границы опухоли или проникают вглубь неопластической ткани по ходу кровеносных сосудов (указаны стрелками); Б плотное скопление флуоресцирующих клеток на 5-й день после инфузии. ГСК с сохранной морфологией группируются в глубине опухоли среди ее клеток (В) или на границе с интактной тканью мозга (Г). Ядра докрашены DAPI. Масштаб 200 мкм.