Были подробно описаны типы КПГ, вступивших на путь дифференцировки. В настоящее время в пуле коммитированных КПГ выделяют несколько популяций. На 1418-й день после посева колонии в культуре образуется КОЕ-бласт клоны из 401000 клеток без окончательной дифференцировки, с высокой способностью к самоподдержанию, которые при вторичных пересевах генерируют гетерогенные колонии из зрелых гемопоэтических клеток. Возможно, КОЕ-бласт это переходная форма от ГСК к коммитированным КПГ (Leary, Ogawa, 1987; Rowley et al., 1987). КОЕ-бласт как клетки, инициирующие долгосрочные культуры, определяются рядом авторов как плюрипотентные.
Следующая в ряду дифференцировок общий предшественник всех линий гемопоэза с высоким пролиферативным потенциалом полипотентная КОЕ-ГЕММ (колониеобразующая единица гранулоцитов, эритроцитов, макрофагов и мегакариоцитов). Клетки именно этого пула восполняют при необходимости все ростки гемопоэза. В культуре КОЕ-ГЕММ образует смешанные колонии, в их составе обнаруживаются гранулоциты, эритроидные клетки, мегакариоциты и макрофаги. Клетки данной субпопуляции способны восстанавливать и лимфоидное звено, что было доказано методами меченых генов в сочетании с клонированием клеток (Чертков, Дризе, 1998; Lemieux et al., 1995). КОЕ-ГЕММ очень гетерогенны по размеру и составу, потенциал пролиферации у большей части клеток данного пула чрезвычайно высок, а грань между КОЕ-ГЕММ и СГК несколько размыта; возможно, часть клеток, формирующих такие колонии, могут быть отнесены к разряду стволовых.
Бипотентные клетки-предшественники относятся к разряду коммитированных в отношении миелоидного ростка гемопоэза предшественников, способных дифференцироваться по 2 направлениям. К данному классу клеток-предшественников относят КОЕ-ГМ колониеобразующие единицы гранулоцитов, макрофагов, а также БОЕ-Э/Мег раннего общего предшественника эритроцитов и мегакариоцитов (Bol, Williams, 1980; Debile, Columbel, 1996; Ferrero, Broxmeyer, 1983). БОЕ-Э/Мег представлены эритробластами в окружении мегакариоцитов, а КОЕ-ГМ формируют гетерогенные лейкоцитарные колонии в культуре полужидких (вязких) сред на 12-й день от посева и состоят из 1001000 клеток. (Debile, Columbel, 1996). С точки зрения характеристики трансплантационного материала именно данный класс предшественников имеет наибольшее значение. КОЕ-ГМ определяет быстрое восстановление нейтрофильного звена, тогда как БОЕ-Э/Мег обеспечивают восполнение гемопоэза тромбоцитами и формируют красный росток.
Унипотентные клетки-предшественники: клоногенные предшественники гранулоцитов (КОЕ-Г), макрофагов (КОЕ-М) так же, как и КОЕ-ГМ, формируют колонии как минимум из 2050 зрелых клеток (более 50 критерий других лабораторий). При этом клеточные колонии гранулоцитов, содержащие меньшее число клеток, определены как кластеры, большие и малые (1020 и 2050 клеток соответственно). Кроме того, некоторыми исследователями принято, что гранулоцитарные колонии, содержащие более 500 клеток, соответствуют наиболее ранним гемопоэтическим предшественникам (в литературе встречаются термины «пре-КОЕ-Г» и «пре-КOЕ-ГМ»), подобным ранним эритроидным предшественникам (БОЕ-Э бурстобразующие единицы эритроцитов) (Bender, van Epps, 1991; Cashman et al., 1983). БОЕ-Э формируются ранними эритроидными предшественниками на 1820-й день от посева, могут быть малыми включают 38 кластеров, средними включают 916 кластеров, и большими более 16 кластеров. Наиболее зрелые эритроидные предшественники колониеформирующие единицы эритроцитов (КОЕ-Е) образуют 1 или 2 кластера из 8100 гемоглобинизированных эритробластов. Колонии такого типа формируются к 1012-му дню с момента посева. Все клетки класса унипотентных обладают низкой способностью к самоподдержанию и высоким потенциалом пролиферации, обеспечивая быстрое, но кратковременное восстановление определенного (каждая единица лишь одного) ростка гемопоэза. Материал с преобладанием гемопоэтических клеток-предшественников такого уровня дифференцировки наиболее успешно может быть применен в качестве гематологической поддержки при проведении полужестких химиотерапевтических режимов.
По мере накопления знаний в области изучения клоногенных предшественников были определены нормы количественного содержания различных колониеобразующих единиц при посеве 200 тыс. мононуклеарных клеток костного мозга и 1 мл нормальной периферической крови (табл. 1).
Данные, получаемые при оценке колониеобразования клеток крови, включая КПГ, имеют большое значение с точки зрения качества гематологического материала, который будет применен с целью гематологической поддержки при высокодозной химиотерапии.
Длительное время оценка качества гемопоэтического материала при аутологичной трансплантации проводилась на основании определения роста колоний клеток в различных полужидких системах. Однако отсутствие единых стандартов данного теста из-за многообразия реактивов, а также временная отсрочка в получении результатов делали достаточно информативный метод колониеобразования не совсем удобным для клинического применения.
И всегда возникал вопрос определения момента начала проведения сборов ПСК. Гематологические показатели крови не всегда отражали реальный выброс клеток-предшественников в периферическое русло, и часто сборы требовали проведения более 3 повторных сеансов аферезов.
Данная проблема была решена с момента открытия антигена CD34
Внедрение в клиническую практику методов проточной цитометрии позволило оценить фенотип клеточной мембраны с помощью моноклональных антител к различным дифференцировочным антигенам. Стало возможным иммунофенотипически охарактеризовать все типы КПГ, включая СГК, и иммунологически различать клетки-предшественники различных классов по уровням коэкспресии на CD34
+
Было установлено, что в норме популяция CD34
+
В настоящее время используется несколько моноклональных антител (МКА) к молекуле CD34: My10, HPCA2, ICH3, IMM3, ICO115, QBEND10 с различными спектрами чувствительности к данной молекуле и ее функциональным эпитопам. Показано, что наиболее качественными с точки зрения определения количеств циркулирующих КПГ являются МКА HPCA-2 с изотипом IgG-1 (Andrews et al., 1986; Loken, 1987; Siena et al., 1991).
Разработано несколько цитометрических протоколов для корректной оценки количества CD34
+
+
+
Важным моментом изучения CD34
+
+
Исследование коэкспрессии на CD34
+
Так, общее число CD34
+
+
По мере дифференцировки СКК от истинно стволовых до линейно рестриктированных унипотентных происходят изменения мембранного фенотипа клеток. Иммунологический фенотип CD34
+
+
В настоящее время имеются достаточно четкие представления о соответствии между уровнем дифференцировки стволовой клетки или клетки-предшественника и иммунологическим фенотипом ее мембраны (Lanza et al., 2001; Seita et al., 2010).
Говоря об иммунологическом фенотипе клетки, мы подразумеваем под этим целый спектр антигенов и рецепторных молекул экспрессируемых, т.е. присутствующих на мембране и (или) в цитоплазме клетки.
Наиболее ранней стволовой, линейно не рестриктированной (не приобретшей черты какого-либо направления дифференцировки) соответствует клетка, экспрессирующая антиген CD34, но отрицательная в отношении экспрессии таких линейно неограниченных антигенов, как HLA-DR и CD38. Рядом исследований показано, что на клетке такого уровня может выявляться слабая экспрессия молекулы Thy-1, большинство из изотипов которой экспрессируются клетками негемопоэтической природы (DArena et al., 1998; Humeau et al., 1996; Mayani et al., 1994). Таким образом, истинной СКК может удовлетворять иммунофенотип CD34
+
±
Стволовым кроветворным клеткам, только вступившим в цикл дифференцировок, инициирующим рост долгосрочных клеточных культур (КИ-ДККM) и формирующим селезеночные колонии у мышей, с точки зрения иммунологического фенотипа могут соответствовать сразу несколько популяций. Экспрессия антигена CD34 на подобных клетках выраженная (CD34
++
На части клеток выявляется молекула CD90, и целый ряд работ подтверждает возможность экспрессии панмиелоидных антигенов CD13, CD33. Однако большинство клеток пула КИ-ДККМ являются CD13
Неоднозначной является экспрессия клетками данного уровня дифференцировки молекулы трансферринового рецептора CD71. Классически принято относить данный антиген к клеткам-предшественникам эритроидного ростка (van Dongen et al., 2012), но экспрессия данного антигена возможна на активно пролиферирующих кроветворных клетках ранних этапов дифференцировки.
Именно клетки пула КИ-ДККМ, наряду с истинно стволовыми СКК, способны длительно поддерживать травмированный гемопоэз.
Следующий этап дифференцировки это уже коммитированные клетки-предшественники. Данному уровню соответствуют полипотентные СКК, формирующие крупные смешанные колонии гранулоцитов, макрофагов, мегакариоцитов, эритроцитов (КОЕ-ГЕММ), а также бурст-образующие клетки (БОЕ), полипотентные в отношении миеломоноцитарного и эритроидного (с его преобладанием) ростков. Клетки, формирующие колонии подобного рода, наряду с выраженной экспрессией стволовоклеточного антигена CD34, позитивны в отношении линейно не ограниченных антигенов HLA-DR и CD38, кроме того, имеют четкие признаки миелоидной направленности дифференцировки (CD13
+
+
+
+
+
Завершают ряд коммитированных СКК бипотентные (КОЕ-ГМ) и унипотентные (КОЕ-М, КОЕ-Г) миелидно-коммитированные клетки-предшественники, различающиеся по уровням экспрессии панмиелоидных антигенов CD13 и CD33. Естественно, существует и унипотентный лимфоидно коммитированный росток. Однако клетки данных субпопуляций практически не формируют краткосрочных колоний, и изучение СКК данного пула возможно только с применением иммунологических методов.
Именно пул линейно коммитированных (КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-М, КОЕ-Г) клеток обеспечивает при трансплантации кроветворной ткани достаточно быстрое восстановление как лейкоцитов (в основном за счет нейтрофилов), так и тромбоцитов (популяция полипотентных КОЕ-ГЕММ).
С точки зрения фенотипических характеристик клеточной мембраны стволовым клеткам соответствует популяция CD34
++
/+
Поэтому изучение уровней коэкспрессии антигенов CD38 и HLA-DR на CD34
+
++
Конечно, была подробно изучена экспрессия ГСК и общелейкоцитарного антигена CD45, определяющего все клетки гемопоэтической природы. Показано, что все CD34
+
+
Несомненный интерес представляет оценка коэкспрессии на мембране ГСК трансферринового рецептора, антигена CD71. Экспрессия CD71 описана в ходе созревания эритроидных клеток. Данный антиген представлен на пролиферирующих клетках и на эритроидных предшественниках (БОЕ-Э/КОЕ-Э) (Olweus, 1998; Sieff et al., 1987).
Изучение коэкспрессии антигена CD71 на клетках костного мозга показало, что фракция CD34
+
++
++
++
+
+
++
+
++
++
+
+
+
Изучению роли Thy-1 антигена (CD90) на CD34
+
+
+
+
В последнее время показано, что ранние гемопоэтические клетки-предшественники экспрессируют антигены миелоидного ростка CD33 и CD13. Продемонстрирована экспрессия CD33 на КОЕ-ГЕММ, в дополнение к экспрессии на КОЕ-ГМ и КОЕ-Э; таким образом, CD33 является маркером КПГ, коммитированных в направлении миелоидного ростка. Позднее было показано, что КОЕ-ВПП содержат CD33
+
+
++
+
Подобно CD33, CD13 является маркером начального миелопоэза, однако было обнаружено, что клетки-предшественники эмбриональной печени с фенотипом CD34
++
++
/+
+
Кроме перечисленных антигенов ранних этапов дифференцировки, на клетках-предшественниках отмечена экспрессия целого ряда более поздних кластеров дифференцировки.
Описана также коэкспрессия на КПГ линейно рестриктированных маркеров лимфоидного звена, как Т-клеток, так и В-клеток. В частности, описана небольшая фракция CD34
+
+
+
+
+
+
+
-/+
В отношении В-клеточной лимфоидной рестрикции (Janossy et al., 1991) к сказанному выше следует добавить, что пропорции CD34
+
+
+
Изучение субпопуляционного состава ГСК не только является фундаментальным аспектом, дающим более детальное представление о биологии стволовой клетки, но также очень важно с практической точки зрения. Не секрет, что у части больных мобилизация бывает неуспешной, а у части, даже в случае набора достаточной для восстановления кроветворения дозы стволовых кроветворных клеток, оптимального восстановления одного или нескольких ростков не происходит. Одним из возможных объяснений являются особенности субпопуляционного состава CD34
+
+
+
45/low
Нозологическая форма заболевания у онкологических пациентов также отразилась на субпопуляционном составе мобилизованных СКК (Гривцова, 2016). Кроме того, оказалось, что субпопуляционный состав СК отличается у онкологических больных взрослого возраста и детей, больных раком; также имеются различия в количестве отдельных субпопуляций у онкологических больных и здоровых доноров (Grivtsova, Tupitsin, 2016).
Исследования субпопуляционного состава мобилизованных ГСК значимы не только для онкологических больных; изучаются особенности пула стволовых клеток и при других фатальных заболеваниях, таких как боковой амиотрофический склероз (Tupitsyn et al., 2006). Показано, что мобилизованные СК (CD34
+
gp130CD130+
+
gp130-+
Таким образом, особое значение, на наш взгляд, приобретает исследование субпопуляционного состава CD34
+
+
Детальные сведения о мембранном иммунофенотипе стволовой клетки, а соответственно, и о субпопуляционном составе пула стволовых кроветворных клеток чрезвычайно важны как с клинических (прогноз скорости восстановления каждого конкретного кроветворного ростка), так и с фундаментальных (понимание особенностей дифференцировки нормальных клеток крови на ранних этапах кроветворения) позиций.
С учетом полученных различий в субпопуляционном составе ГСК у онкологических больных разного возраста и здоровых доноров можно взглянуть на проблему более широко и обсуждать возможность присутствия у онкологических больных некоего травмированного пула ГСК.
Несмотря на то что трансплантация ГСК и трансплантация костного мозга осуществляется в России более 70 лет, специальных отечественных препаратов, содержащих ГСК, не существует, а трансплантации ГСК и подбор доноров костного мозга осуществляются только как «трансплантация костного мозга», на основе гистосовместимости и количества ГСК. Не существует и официальных клеточных препаратов для восстановления поврежденного гемопоэза после химиотерапии (ХТ) и лучевой терапии (ЛТ). При угнетении миелоидного ростка при ХТ или ЛТ (преимущественно при облучении плоских костей грудины и таза) быстро (712 дней) или отсроченно (36 нед.) возникает нейтропения, опасная развитием инфекционных осложнений, грибковых поражений, повреждений кожи (мукозид, раны, трещины); присоединяются сопутствующий иммунодефицит и ЦМВ-инфекция. К лечению добавляют антибиотики для лечения внутритканевой инфекции и Г-КСФ (нейпоген, граноцид, нейпомакс, грановесил и т.д.). Тромбоцитопения опасна развитием геморрагического диатеза, поэтому применяется тромбоцитопенический концентрат. Поэтому вопрос о новых клеточных продуктах, которые могут быть использованы для терапии осложнений и побочных эффектов ХТ и ЛТ опухолей, по-прежнему крайне актуален для современной отечественной и мировой онкологии. И перспективными здесь могут оказаться и стволовые кроветворные клетки в том числе.