Лекарственная устойчивость бактерий
Существуют два типа лекарственной устойчивости бактерий: естественная, или природная, и приобретенная.
Естественная лекарственная устойчивость является видовым признаком. Она присуща всем представителям данного вида и не зависит от первичного контакта (контактов) с данным антибиотиком, в ее основе нет никаких специфических механизмов. Чаще всего эта резистентность связана с недоступностью мишеней для данного антибиотика, обусловленной очень слабой проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, или какими-либо другими причинами. Если низкая проницаемость свойственна нескольким антибиотикам, то она будет обусловливать полирезистентность таких бактерий.
Приобретенная лекарственная устойчивость возникает у отдельных представителей данного вида бактерий только в результате изменения их генома. Возможны два варианта генетических изменений. Один из них связан с мутациями в тех или иных генах бактериальной хромосомы, вследствие которых продукт атакуемого гена перестает быть мишенью для данного антибиотика. Это происходит либо вследствие изменения структуры белка, либо потому, что он становится недоступным для антибиотика.
В другом случае бактерии становятся устойчивыми к антибиотику или даже сразу к нескольким антибиотикам благодаря приобретению дополнительных генов, носителями которых являются R-плазмиды. Никаких других механизмов приобретенной лекарственной устойчивости не существует. Однако, приобретая устойчивость к антибиотику, а тем более сразу к нескольким антибиотикам, такие бактерии получают наивыгоднейшие преимущества: благодаря селективному давлению антибиотиков происходит вытеснение чувствительных к ним штаммов данного вида, а антибиотикоустойчивые варианты выживают и начинают играть главную роль в эпидемиологии данного заболевания. Именно они и становятся источниками формирования тех клонов бактерий, которые обеспечивают эпидемическое распространение возбудителя. Решающую роль в распространении лекарственной устойчивости, в том числе множественной, играют R-плазмиды благодаря способности их к самопереносу.
Биохимические основы антибиотикорезистентности
Можно выделить следующие пять биохимических механизмов формирования резистентности:
1. Разрушение молекулы антибиотика. Такой механизм лежит главным образом в основе формирования устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. Бета-лактамазы, разрушая структуру пенициллинов и цефалоспоринов, обеспечивают устойчивость к ним бактерий.
2. Модификация структуры молекулы антибиотика, в результате которой утрачивается ее биологическая активность. Гены, содержащиеся в R-плазмидах, кодируют белки, которые вызывают различные модификации молекул антибиотика путем их ацетилирования, фосфорилирования или аденилирования. Именно таким путем инактивируются аминогликозиды, макролиды, хлорамфеникол, клиндамицин и другие антибиотики. Существуют целые семейства генов, определяющих инактивацию того или иного антибиотика даже по одному из указанных выше механизмов. Например, среди клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий обнаружены различные изоферменты аминогликозидфосфо-, – ацетил– и – аденилтрансфераз, обеспечивающие устойчивость бактерий к различным спектрам аминогликозидных антибиотиков.
3. Изменение структуры чувствительных к действию антибиотиков мишеней. Изменение структуры белков рибосом 70S лежит в основе устойчивости к стрептомицину, аминогликозидам, макролидам, тетрациклинам и другим антибиотикам. Изменение структуры бактериальных гираз в результате мутации приводит к формированию устойчивости к хинолонам; РНК-полимераз – к рифампицину; пенициллинсвязывающих белков (транспептидаз) – к бета-лактамам и т. п.
4. Образование бактериями "обходного" пути метаболизма для биосинтеза белка-мишени, который оказывается нечувствительным к данному химиопрепарату, – механизм, который лежит в основе резистентности к сульфаниламидным препаратам. 5. Формирование механизма активного выведения из клетки антибиотика, в результате чего он не успевает достичь своей мишени (один из вариантов устойчивости к тетрациклинам).
Необычный механизм устойчивости к изониазиду обнаружен у Mycobacterium tuberculosis. Действие изониазида на туберкулезную палочку зависит от наличия у последней плазмиды, в составе которой имеется особый ген. Продукт этого гена превращает неактивный изониазид в активную форму, которая разрушает бактериальную клетку. Утрата этого гена обусловливает устойчивость M. tuberculosis к изониазиду.
В некоторых случаях инактивацию антибиотиков, которая лежит в основе резистентности к ним, бактерии могут осуществлять разными механизмами. Так, например, существует три механизма, ответственных за формирование устойчивости к бета-лактамным антибиотикам: слабая проницаемость наружной мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, обеспечивающая природную устойчивость; изменение структуры пенициллинсвязывающих белков в результате мутаций, которое приводит к утрате их сродства к антибиотику; продукция бета-лактамаз, разрушающих антибиотик. Существует три типа устойчивости и к тетрациклинам: 1) устойчивость, определяемая выносом тетрациклина из клетки белком цитоплазматической мембраны; 2) устойчивость, определяемая изменением структуры белка-мишени рибосом; 3) устойчивость, определяемая модификацией тетрациклина в неактивную форму.
Возможно, у бактерий существуют и другие механизмы формирования устойчивости к лекарственным препаратам.
Таким образом, в ответ на мощный натиск, который предпринял человек на бактерии с помощью антибиотиков, они ответили уникальными биологическими реакциями, сила которых не уступает силе атаки. На каждый новый антибиотик бактерии давали адекватный ответ: появлялись резистентные к нему штаммы, которые и сводили на нет биологическую активность этого препарата. Так было и так будет всегда. С этим нельзя не считаться и этого нельзя не учитывать. Поэтому следует постоянно искать пути преодоления этого препятствия, ибо пока существуют инфекционные болезни, их надо уметь эффективно лечить. Пути преодоления устойчивости к лекарственным препаратам будут рассмотрены ниже.
Возникает вопрос: каковы возможности и пути образования лекарственной устойчивости у бактерий? Поскольку они формируются только на генетическом уровне, то возникает и другой вопрос: откуда появляются новые гены лекарственной устойчивости? Устойчивость, возникающая как следствие мутации, объяснима и понятна, но не она играет основную роль. Основная роль принадлежит генам, которые содержатся в R-плазмидах, а они ведь не могут возникать сразу, de novo. Следовательно, в природе должен существовать своеобразный фонд генов лекарственной устойчивости, откуда бактерии могут постоянно "захватывать" те гены, которые необходимы для них в данной ситуации. Наиболее вероятно, что такой фонд образуется за счет генов, имеющихся у продуцентов антибиотиков. Каждый из них защищен от синтезируемого им антибиотика. Эта самозащита контролируется соответствующим геном. Следовательно, сколько бы ни было в природе антибиотиков, против каждого из них должен быть и ген самозащиты, ген устойчивости к этому антибиотику. В природе, особенно в почве, а также в кишечнике человека и животных, микроорганизмы сосуществуют в столь тесных взаимоотношениях, что это обеспечивает им постоянную возможность обмена генетическим материалом с помощью различных механизмов, в том числе с помощью конъюгации. Поскольку многие гены лекарственной устойчивости несут в себе транспонируемые элементы, это обеспечивает им высокую мобильность. Они могут перемещаться внутри хромосомы, переходить из хромосом в плазмиды, формировать новые варианты плазмид и подвергаться другим превращениям. Таким образом, обмен генами лекарственной устойчивости между микроорганизмами в естественных условиях, очевидно, вполне возможен. Решающую роль в их распространении среди возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных начинает играть уже сам антибиотик. Опыт показывает, что раньше всего гены лекарственной устойчивости к каждому новому антибиотику появляются у клинических штаммов, а затем начинается их дальнейшая циркуляция в природе. Обладая определенной мобильностью, эти гены сами подвергаются модификации, мутациям, а в результате образуют группы, семейства генов, определяющих устойчивость к различным вариантам модифицированного антибиотика. Хотя многое еще придется изучить в этом плане, но общая тенденция и масштабы развития у бактерий лекарственной устойчивости уже вполне объяснимы.
Каковы же возможные перспективы поиска новых антибиотиков, иначе говоря, какими новыми свойствами должны обладать новые антибиотики, чтобы преодолеть известные у бактерий механизмы защиты от них?
Желателен поиск таких антибиотиков, которые бы:
1) имели иную молекулярную структуру и иные мишени в бактериальной клетке, отсутствующие (или, по крайней мере, хорошо защищенные от данного антибиотика) в эукариотной клетке;
2) обладали новым механизмом транспорта в бактериальную клетку;
3) были бы нечувствительны к защитным ферментам и не индуцировали бы их синтез;
4) отвечали бы всем остальным требованиям, предъявляемым к антибиотикам.
Способы определения чувствительности (резистентности) бактерий к химиопрепаратам
Чувствительными к антибиотикам и химиопрепаратам в клинической практике считаются те микроорганизмы, на которые препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. Поэтому критерии чувствительности возбудителя зависят от концентрации лечебного препарата в очаге инфекции, величины максимальной терапевтической дозы химиопрепарата, его фармакокинетики и токсичности.
Существуют различные способы определения чувствительности бактерий к антибиотикам, но чаще всего используются два из них: метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, пропитанных антибиотиком, и метод серийных разведений антибиотика.
Первый из них заключается в использовании заранее приготовленных из фильтровального картона дисков диаметром 6 ± 0,5 мм. В России выпускается более 20 стандартных дисков. Содержание антибиотика в диске указано на этикетке и соответствует рекомендациям ВОЗ. Содержание антибиотика в диске варьирует в зависимости от его терапевтической дозы и выражается в мкг/мл или в единицах действия (ЕД). Диски одного наименования содержат одну дозу антибиотика; она составляет: 5 мкг/мл (рифампицин), 6 мкг/мл или 10 мкг/мл (бензилпенициллин), 10 мкг/мл (ампициллин, метициллин, оксациллин, гентамицин, сизомицин, доксициклин, фузидин), 15 мкг/мл (эритромицин, линкомицин, олеандомицин), 25 мкг/мл (карбенициллин), 30 мкг/мл (цефалексин, цефалотин, неомицин, стрептомицин, канамицин, мономицин, тетрациклин, левомицетин, ристомицин), 300 ЕД (полимиксин). Диски с различными антибиотиками отличаются друг от друга по цвету (белые, зеленые, желтые и т. д.) или коду, который представляет собой первую букву названия антибиотика, вытисненную на диске.
Поскольку определяемая in vitro степень чувствительности микробов к антибиотикам зависит от условий опыта, для получения достоверных и воспроизводимых результатов необходимо точное соблюдение правил, регламентированных соответствующими методическими указаниями, а также использование стандартных питательных сред и дисков. Оценка результатов определения чувствительности основана на установлении зависимости между размером зон подавления роста исследуемых культур вокруг дисков с антибиотиками и значениями минимальных подавляющих концентраций (МПК) соответствующих антибиотиков в отношении тех или иных культур. Установление такой зависимости в соответствии с методическими указаниями позволяет придать оценке результатов полуколичественный характер и отнести исследуемые культуры бактерий к одной из трех категорий: устойчивые, умеренно устойчивые, чувствительные.
Для испытания чувствительности диски с антибиотиками наносят на поверхность агара, на который перед этим засевают исследуемую культуру. На одну чашку помещают не более 6 дисков. Чашки инкубируют в термостате в течение 18 – 20 часов при температуре 35 – 37 °C. После этого с помощью линейки измеряют диаметр зон задержки роста вокруг дисков (включая диаметр самих дисков) с точностью до 1 мм (рис. 59). Оценку результатов проводят с помощью специальной таблицы, имеющейся в "Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков" (1983). Эта таблица содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов. Перечень основных микроорганизмов, подлежащих эпидемиологическому наблюдению, и их кодовые наименования приведены в табл. 7.
Более точным является количественный метод, позволяющий определить минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика, выраженную в мкг/мл. С этой целью делают серийные разведения антибиотика и добавляют их в жидкую или плотную питательную среду, а затем определяют, при какой минимальной концентрации антибиотика произошло подавление роста исследуемого штамма возбудителя.
Рис. 59. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам с помощью стандартных дисков
Таблица 7
Основные микроорганизмы – возбудители инфекционно-воспалительных заболеваний
Примечание. Кодовые наименования соответствуют протоколу ВОЗ.
Бактериологические анализаторы. С целью совершенствования методов бактериологической диагностики инфекционных заболеваний и одновременного определения чувствительности возбудителя к антибиотикам разработаны и широко внедряются в практику различные автоматические и полуавтоматические бактериологические анализаторы, которые позволяют избавить бактериолога от значительной части рутинной работы, в широких пределах проводить идентификацию культуры и изучать ее чувствительность к антибактериальным препаратам, быстро получая достоверные результаты. В комплект автоматического бактериологического анализатора (например, серии WalkAway компании Dade AG) входят автоматический анализатор с поддержанием постоянной температуры и влажности, персональный компьютер с программным обеспечением, принтер для нанесения штриховых кодов и принтер для распечатки результатов, прибор для стандартизации мутности. С помощью инокулятора-регидратора суспензия первично выделенной культуры переносится в панели с ячейками, содержащими различные тест-субстраты (более 30), с помощью которых за короткий срок удается дифференцировать многие виды бактерий по их биохимическим свойствам. Кроме того, имеются панели с ячейками, содержащими антибиотики (более 40 препаратов в 30 различных комбинациях). Идентификация и проверка чувствительности к антибиотикам осуществляются за 2 – 3,5 ч спектрофотометрическим и флуоресцентным методами. Система позволяет идентифицировать более 300 видов микроорганизмов, в том числе грамположительные, грамотрицательные, грибы, анаэробы и др. Программное обеспечение позволяет выбирать наиболее эффективный лекарственный препарат с учетом путей его введения, контролировать проводимую антибиотикотерапию, осуществлять ее стоимостный анализ, а также решать вопросы эпидемиологического анализа и контроля, сохранять и обрабатывать полученную информацию.
Побочные реакции, наблюдаемые при антибиотикотерапии
Хотя к антибиотикам предъявляются жесткие требования в отношении их безвредности для человека, в некоторых случаях, особенно при неоднократном или длительном применении, наблюдаются нежелательные реакции, которые можно разделить на следующие 4 группы: аллергические, токсические, эндотоксические и дисбактериозы. Аллергические реакции наблюдаются в тех случаях, когда антибиотик выступает в качестве аллергена. Они не зависят от дозы введенного препарата, могут наступать за первым введением его, но обычно возникают в результате постепенной сенсибилизации при повторных применениях антибиотика. Могут носить характер крапивницы, дерматита, сыпи, ринита и т. п. Наибольшую опасность представляет пенициллиновый шок – реакция гиперчувствительности немедленного типа.
Токсические реакции возникают чаще всего в связи с органотропным фармакодинамическим действием антибиотика и при продолжительном лечении. Проявляются в виде поражения вестибулярного аппарата (неомицин, канамицин, стрептомицин, флоримицин и некоторые другие), почек (полимиксин, бацитрацин, неомицин, мономицин, канамицин, стрептомицин, амфотерицин В и некоторые другие), периферических нервов, различных поражений ЦНС (циклосерин, неомицин, полимиксин, гризеофульвин, пенициллин, стрептомицин и некоторые другие) и других нарушений.
Наиболее тяжелым бывает токсическое воздействие на кровь: агранулоцитоз, апластическая анемия (левомицетин).
Эндотоксические реакции развиваются в тех случаях, когда под влиянием антибиотика происходит массовое разрушение грамотрицательных бактерий, сопровождающееся выделением и поступлением в кровь их эндотоксина (липополисахарида).
Одним из самых частых осложнений, особенно при длительном применении антибиотиков с широким антимикробным спектром, являются дисбактериозы. Они развиваются в результате того, что применяемый антибиотик действует не только на возбудителя, но и на нормальную микрофлору, угнетая ее. Это ведет к тому, что беспрепятственно начинают размножаться те микроорганизмы, которые к этому антибиотику нечувствительны. Чаще всего это стафилококки, дрожжеподобные грибы Candida, клостридии, некоторые грамотрицательные палочки (псевдомонады, протей и др.). Наиболее тяжело протекают генерализованный кандидоз (кандидосепсис); стафилококковый энтероколит; псевдомембранозный колит, вызываемый Clostridium difficile; вторичные пневмонии, вызываемые стафилококком и грамотрицательными палочками.