document:
$pr:
version: 01-2007.1
codepage: windows-1251
type: klinrek
id: kli13235097
: 01.2. ГЕНЕТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ
meta:
author:
fio[ru]: Г.Ю. Бабаджанова, Н.А. Дидковский
codes:
next:
type: dklinrek
code: I.I
Наряду с заболеваниями, этиологически строго детерминированными наследственностью (генные и хромосомные) или факторами внешней среды (травмы, ожоги), есть большая и нозологически разнообразная группа заболеваний, развитие которых определяется взаимодействием определенных наследственных факторов (мутации или сочетания аллелей) и факторов среды. Эта группа называется заболеваниями с наследственной предрасположенностью.
Заболевания с наследственной предрасположенностью возникают у лиц с соответствующим генотипом (сочетание «предрасполагающих» аллелей) при провоцирующем действии факторов среды. Именно к данной группе болезней и относятся заболевания бронхолегочной системы.
Наследственная предрасположенность к болезни может иметь полигенную и моногенную основу. Моногенная наследственная предрасположенность определяется одним геном, т.е. связана с патологической мутацией данного гена, но для патологического проявления мутации требуется обязательное действие одного или нескольких факторов внешней среды, которые обычно точно идентифицируются и по отношению к данной болезни могут рассматриваться как специфические. Пример такого заболевания среди бронхолегочных - муковисцидоз (МВ).
Полигенная наследственная предрасположенность определяется сочетанием аллелей нескольких генов. Свой патологический потенциал они проявляют вместе с комплексом нескольких факторов внешней среды. Это мультифакториальные заболевания (МФЗ). Соотносительная роль генетических и средовых факторов различна не только для даннoго заболевания, но и для каждого больного. Яркий пример мультифакториального заболевания среди бронхолегочных - бронхиальная астма (БА).
Таким образом, заболевания респираторного тракта в своем большинстве вызваны целым рядом факторов. К ним относятся факторы внешней среды, генетические и случайные.
type: dkli00010
ГЕННО-ТЕХНИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ РИСКА БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Геннотехнический анализ генов риска бронхолегочных заболеваний можно разделить на три составляющие.
ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕФЕКТОВ ПРОТЕИНОВ.
Молекулярно-генетические технологии используются для характеристики дефектов протеинов с известной физиологической функцией. Благодаря представлениям о дефектах на уровне дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и проистекающих отсюда нарушениях на уровне транскрипции, трансляции и посттрансляционных модификаций можно достичь углубленного понимания молекулярных механизмов патологии. Это хорошо видно в связи с анализом альфа<sub>1</sub>антитрипсина, который хорошо изучен при МВ (дефектный CFTRпротеин и цитохром b558). В некоторых случаях доказательство генетического дефекта на уровне ДНК значительно проще, чем на уровне протеина, что позволяет использовать молекулярно-генетические технологии для улучшения диагностических возможностей [15]. Это справедливо прежде всего для тех патогенетически релевантных генов, которые можно выделить только из специфических тканей и протеиновые продукты которых невозможно обнаружить в крови или других клинически легко получаемых пробах.
ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ РИСКА.
Помимо известных стратегических знаний о структуре и функции соответствующих заболеванию протеинов, существует метод - «анализ сцепления» - для идентификации патогенетических генов и их протеиновых продуктов. Анализ сцепления проводят в семьях с каким-либо моногенным заболеванием, при этом ищут связь этого заболевания с известными генетическими маркерами, т.е. выясняют, наследуется ли данное заболевание вместе с известными маркерами («сцеплено» ли оно с ними). На этом основании нельзя сразу обнаружить вид и функцию «виновного» гена или его протеина, поэтому сначала определяют лишь его локализацию в человеческом геноме. Позже сам ген клонируют, а его протеиновый продукт описывают. Так, в рамках различных геномных проектов создают карты человеческого генома, в которых обозначены позиции многих сотен генетических маркеров и которые можно использовать для анализа сцепления. Если для одного из маркеров находят тесное сцепление с заболеванием, это показывает, что ген заболевания локализуется в непосредственном соседстве с маркером, и если тем самым можно идентифицировать примерную позицию гена в геноме, то, как следствие, возможна изоляция гена из соответствующего банка. Технику позиционного клонирования успешно применяют для локализации и изолирования генов. Анализ сцепления применяли для идентификации генов МВ [29], гена хронического гранулематозного заболевания и даже для некоторых продуктов иммуноглобулина Е [8].
АНАЛИЗ КАНДИДАТНЫХ ГЕНОВ.
Кроме молекулярной характеристики протеиновых аномалий и позиционного клонирования генов сегодня для выяснения генетической предрасположенности к заболеваниям в распоряжении исследователя имеется и прямой генно-технический анализ кандидатных генов, т.е. генов с предполагаемым патогенетическим вкладом. Этот метод особенно предпочтителен при комплексных, полигенных заболеваниях - коронарной патологии сердца, сахарном диабете 2го типа, опухолевых заболеваниях [2]. Цель метода - идентификация важнейших генов риска для этих заболеваний и их наиболее частых аллельных дефектов. Естественно, генетический анализ комплексных заболеваний намного сложнее, чем моногенных, но их высокая частота и большое клиническое значение вызывают неизменный интерес у генетиков. Анализ кандидатных генов предполагает высокоразвитые генно-технические методы для выявления мутаций: применяют различные генно-сканирующие технологии, разработанные именно для выявления кандидатных генов.
type: dkli00011
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Человеческий геном сегодня практически полностью расшифрован. Изучение структурного анализа такого сложного генома стало возможным благодаря развитию большого числа высокоэффективных молекулярно-генетических технологий. Развитие аналитического инструментария позволило провести полное картирование и, как конечную цель, полную последовательность (секвенирование) всего генома [56]. Приведем подробнее некоторые технологии, которые используются для клинического применения и для генетического анализа комплексных заболеваний.
ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.
Клонирование нового гена заболевания - это первый фундаментальный шаг при молекулярно-генетическом анализе какоголибо генетического заболевания. Если отсутствует какаялибо структурная или функциональная предварительная информация о гене, он может быть клонирован при определенных обстоятельствах, на основе его хромосомной локализации. Для этого применяют уже описанный выше анализ сцепления, в котором общее наследование одного генетического маркера и одного заболевания изучается в большой семье с этим заболеванием. При этом маркер ни в коем случае не имеет функционального значения - он является лишь привычным вариантом геномной секвенции (последовательности) ДНК, расположенной вблизи собственно гена заболевания. В случае, когда анализируют достаточно большие семьи с клинически четкими картинами заболеваний, возможно определение локализации гена с большой точностью и надежностью. На заключительном этапе предпринимается попытка при помощи клонирования последующих областей геномной ДНК из целевой области и поиска выделенных в ней последовательностей идентифицировать и выделить сам ген заболевания.
ДРУГИЕ СПОСОБЫ КЛОНИРОВАНИЯ.
При наличии предварительной информации о связанном с заболеванием протеине можно применять другие методы клонирования. Если известны частичные последовательности аминокислот протеина, можно провести скрининг банка генов человека с использованием смесей олигонуклеотидов, соответствующих возможным последовательностям кодона фрагмента протеина. В таком банке генов содержится общий геном человека в фрагментарной форме. При создании банка генов вносят стохастические (случайные) фрагменты геномной ДНК в клетки (кишечная палочка, дрожжи) с помощью векторов (фаги, космиды, эукариотические экспрессионные векторы), в которых они затем размножаются [50]. Типичный репрезентативный космидный или фаговый банк человека содержит около 1 млн индивидуальных клонов, причем каждый - с маленькой собственной частью генома (от 20 000 до 40 000 базовых пар на клон). Если известны биологические функции или антигенные свойства связанного с заболеванием протеина, можно обследовать экспрессионные банки генов с помощью функциональных наборов или специфических антител к клону, содержащему искомый ген. Если такой клон идентифицирован, он может быть размножен in vitro, при этом он производит огромное число копий гена, достаточное для характеристики гена до полного секвенирования и выделения продуктов протеина в чистой форме. Клонирование генов описанными методами - это очень сложный процесс, особенно когда мало предварительной информации об искомом гене.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕННЫХ ДЕФЕКТОВ.
Точным, хотя и дорогостоящим, методом для характеристики генов заболевания у индивидуальных пациентов можно считать клонирование этих генов и полное секвенирование. Грубую информацию о структурных генных повреждениях получают посредством так называемого рестрикционного анализа. При этом геномную ДНК пациентов разрезают с помощью специфических энзимов (рестрикционных эндонуклеаз), разделяют при помощи электрофореза и гибридизируют с помощью специфического генного зонда [48]. Из полученного таким образом рестрикционного образца распознаются большие генные дефекты, а часто даже патогенные точечные мутации. Современная технология, которую можно использовать для быстрого доказательства таких мутаций, и есть так называемая полимеразная цепная реакция - ПЦР [14]. Технология ПЦР используется для диагностики моногенных, а также инфекционных и злокачественных заболеваний. Ее принцип - размножение (амплификация) in vitro сегмента ДНК, имеющегося в мизерном количестве. Это автоматизированный процесс с использованием последовательно специфического праймера - олигонуклеотида и термоустойчивой синтезированной ДНКполимеразы для энзиматического увеличения количества ДНК на выходе. На практике из нескольких микролитров крови пациента выделяют геномную лейкоцитарную ДНК, которая содержит мизерные количества необходимой для исследования целевой последовательности. Для структурного анализа (например, секвенирования) эти количества были бы слишком незначительны, однако с помощью ПЦР они амплифицируются более чем в 106 раз. Помимо геномной ДНК, могут амплифицироваться и секвенироваться индивидуальные рибонуклеиновые кислоты (РНК). Для этого сначала выделяют клеточную общую РНК, которая используется для синтеза in vitro комплементарной ДНК (сДНК), а затем амплифицируется как обычная ДНК с помощью ПЦР.
В последнее время появились методы, позволяющие прямо секвенировать ПЦРпродукты из геномной ДНК без предшествующего клонирования [44]. Эта технология освобождает от необходимости клонирования индивидуального гена и имеет большое значение для характеристики генных дефектов. В распоряжении исследователя для реализации этой технологии имеются специальные радиоактивные и автоматизированные протоколы.
Генное сканирование.
Хотя ПЦРамплификация и прямое секвенирование - очень эффективные и быстрые методы для характеристики генных дефектов человека, все-таки пока есть определенные проблемы. Одна из них - обследование (сканирование) гена в целом на наличие точечных мутаций. Эта проблема возникает, например, при анализе кандидатных генов и подозрении, что они несут при определенном заболевании патогенные мутации, распределенные на протяжении всего гена. В качестве предварительного этапа секвенирования при такой проблеме разработали так называемую технику генного сканирования, которая позволяет ответить на вопрос, имеются ли вообще какие-либо мутации в обследуемой области. Тогда при наличии этой предварительной информации, а затем при окончательной характеристике посредством секвенирования возможно ограничение на действительно нужной (позитивной) области обследования. Все техники сканирования базируются на ПЦРтехнологии и при относительно небольшой трудоемкости позволяют обследовать гены на наличие мутаций у большого числа пробандов.
ТРАНСФЕР ГЕНОВ IN VIVO .
Существуют следующие принципы генной терапии:
---дефектный ген, являющийся причиной моногенного наследственного заболевания, замещается на функционально способный ген (генная аугментация). Примером такой генной терапии может служить тяжелый комбинированный иммунодефицит, когда производится трансфер гена аденозиндезаминазы;
---трансферируется ген, дополнительная экспрессия которого у пациентов при заболевании, не обязательно обусловленном дефектом гена, требует терапевтического воздействия. Примером этого может служить локальная экспрессия цитотоксической субстанции при малигноме;
---дефектный ген замещается функционально способным (здоровым) геном (генная коррекция посредством гомологичной рекомбинации) [11].
В первых клинических исследованиях по генной терапии генный трансфер производился ex vivo. Так, у пациента забирали целевые клетки генной терапии, например гепатоциты, клетки костного мозга или лимфоциты, изменяли их генно-техническим способом вне организма, а затем вводили вновь. В последнее время разработаны такие векторы трансферирующих генов, которые позволяют проводить у людей прямой трансфер генов in vivo. Например, аденовирусные векторы применяют при генной терапии для введения нормального муковисцидозного CFTRгена в эпителий дыхательных путей пациентов, страдающих МВ [10]. Сейчас интенсивно работают над развитием таких векторов, которые позволяют проводить органоспецифический in vivo трансфер в печень, костный мозг, эндотелий сосудов. Разрабатываются и другие способы соматической терапии коррекции гена.
ГЕННОЕ ПРИЦЕЛИВАНИЕ
(Gene Targeting). Для изучения сложных генетических патомеханизмов важно производство трансгенных животных посредством целевого изменения их генома. Животным создают генетические дефекты и анализируют их биологическое влияние на организм в целом. Речь идет о функции таких мутированных генов, воздействие на организм которых неизвестно или известно лишь частично. У трансгенных животных определенные гены могут полностью инактивироваться (Gene Disruption) или целевым образом мутагенизироваться (Targeted Mutagenesis). Была создана модель человеческого МВ на мыши, для чего мутагенизировали мышиный гомолог гена человеческого МВ [7]. Близким способом была создана на мыши модель альфа<sub>1</sub>антитрипсинового дефицита человека. Создают и других трансгенных животных, например для изучения энзима супероксиддисмутазы.
type: dkli00012
ИЗВЕСТНЫЕ ГЕНЫ РИСКА РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ГЕН альфа1-АНТИТРИПСИНА
В начале 1960х годов из человеческой сыворотки был выделен трансингибиторный протеин, названный альфа<sub>1</sub>антитрипсином, или ААТ. ААТ - это гликопротеин острой фазы, он подавляет как трипсин, так и целый ряд серинпротеиназ, а его главная физиологическая роль заключается в ингибировании протеолитического энзима - нейтрофильной эластазы [32]. Дальнейшее изучение ААТ выявило связь между его дефицитом и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Далее были изучены структура, функции и клиническое значение этого протеиназного ингибитора (PI) и показано его аутосомно-рецессивное наследование. Дальнейшее наблюдение за пациентами с ХОБЛ, ассоциированных с ААТ, выявило, что курение значительно ухудшало их состояние и укорачивало жизнь почти на 20 лет [25]. Развитие способов изучения протеина позволило обнаружить новое число выриантов этого протеина, например дефектную аллель Z. Было показано, что некоторые ААТдефектные аллели связаны не только с ХОБЛ, но и с заболеваниями печени: например, гомозиготный носитель Zаллели был связан с циррозом печени у маленьких детей, тяжелой гепатопатии - с дефектом аллели Mmalton и Mduarte [9].
Дальнейший поиск причины связи между заболеваниями легких и недостатком ААТ привел к развитию так называемой протеиназно-антипротеиназной теории . В огромном числе исследований было показано, что различные протеолитические энзимы нарушают матричную структуру легкого, что ведет к неадекватной работе легких. ААТ - доминирующий протеиназный ингибитор в бронхоальвеолярном смыве. С недавних пор в распоряжении врачей имеются препараты ААТ, которые реконструируют в легком эластазноингибиторный потенциал сыворотки у больных с дефицитом ААТ. Его применяют внутривенно или в виде аэрозоля [22].
Развитие современных технологий открыло новые возможности для анализа ААТассоциированных заболеваний. В 1980х годах ААТген был локализован, клонирован и секвенирован на хромосоме 14 [42]. Затем были клонированы и секвенированы многочисленные дефекты ААТгена, охарактеризованы возможные мутации и их влияние на синтез и функцию ААТ. Клонирование и структурный анализ ААТгена позволили провести генетический синтез гликозилированного человеческого ААТ в фибробластах. Появилась возможность прямого трансфера и локальной экспрессии ААТгена в дыхательных путях in vivo с помощью аденовирусного вектора. Генный продукт ААТ уже можно использовать для внутривенного и ингаляционного введения.