ГЕН МВ
Кроме ААТгена, известен другой ген риска - причина МВ. В классических случаях эта болезнь начинается в раннем детстве с рецидивирующей легочной инфекции с выраженной бронхиальной дискринией и гиперпродукцией бронхиального секрета с последующим формированием бронхоэктазов, рецидивирующими пневмониями и хронической обструкцией дыхательных путей. Больные умирают, как правило, рано. МВ часто ассоциируется с экзокринной панкреатической недостаточностью, следствием чего и является дискриния с развитием густого секрета. Причины этого сочетания до конца не выяснены. Помимо бронхов и поджелудочной железы, имеет место специфический дефект потовых желез: такие больные имеют необычно высокое содержание хлорида натрия в поте, что при сильной жаре ведет к его большим потерям, вплоть до развития коллапса.
МВ наряду с недостаточностью альфа<sub>1</sub>антитрипсина - самое частое наследственное заболевание белого населения Европы и Северной Америки, приводящее к смерти. При анализе сцепления CFсемей с помощью молекулярно-генетического маркера в 1985 г. установили локализацию CFгена на хромосоме 7q 31 - 32 [52]. Более точную локализацию и клонирование провели в 1989 г. Название «CFген» следует из его обозначения - Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), этот ген частично секвенирован и клонирован на искусственной дрожжевой хромосоме. Его экспрессия в эпителии дыхательных путей исправляет дефектную регуляцию хлоридного канала в клетках эпителия. Прямой анализ CFTRгена показал, что около <sup>2</sup>/<sub>3</sub> всех CFхромосом несут специфическую мутацию F508 на экзоне 10, а на остальной <sup>1</sup>/<sub>3</sub> имеется большое число последующих мутаций. На сегодняшний день их известно более 170 [40]. Прямой анализ данного гена имеет большое значение для пренатальной диагностики носительства. Наличие DF508, гомозиготы или комбинация с другими CFTRмутациями доказывают диагноз МВ. Затрудняет постановку диагноза лишь то, что еще не все CFTRмутации охарактеризованы, а также различие клинического течения МВ и влияния на них экзогенных факторов. Так же как при ААТгене, имеется возможность прямого трансфера и экспрессии CFTRгена в эпителий дыхательных путей. Сначала эту попытку предприняли на моделях животных, а затем у больных с тяжелым МВ. По этому же принципу провели первые клинические испытания по генной терапии [11].
ГЕН NADPH-ОКСИДАЗНОГО КОМПЛЕКСА
Более 30 лет назад, сразу после описания ААТ, было описано генетическое заболевание, вызванное нарушением антимикробной защитной функции фагоцитов, которое было названо хроническим гранулематозным заболеванием (ХГЗ). Больные страдают повторными бактериальными инфекциями, заканчивающимися в конце концов летально с формированием в легком множественных гранулем. Исследование состояния фагоцитов и метаболизма нейтрофилов у этих пациентов обнаружило, что эти клетки, в отличие от нормальных нейтрофилов, не продуцируют супероксидный радикал (О<sub>2</sub>), и, таким образом, фагоцитированные бактерии не убиваются. Для строительства действенного антимикробного кислородного радикала необходим О<sub>2</sub>оксидредуктазный энзим или NADPHоксидаза, находящаяся в плазматической мембране фагоцитов. Первичным продуктом NADPHоксидазы является супероксидный радикал.
Было показано, что это заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному или Хсцепленному рецессивному типу. Это означает, что заболевание генетически гетерогенно и обусловлено как минимум дефектами двух разных генов: один Хсцепленный, другой - аутосомный. Открытие того, что Хсцепленная форма связана с отсутствием гемопротеина - цитохрома b558, позволяет предположить, что эта форма представлена Хсцепленно кодированной компонентой - NADPHоксидазным комплексом. В 1986 г. ген для Ххромосомной, цитохромb558негативной формы заболевания ХГЗ (Xb) был клонирован в соответствии с его хромосомной локализацией [47]. Ген кодирует тяжелую цепь цитохрома b558. Позже была разъяснена основа цитохромb558активной формы ХГЗ (AB) с дефектом в альфацепи гена. Помимо этих двух форм, при которых отсутствует мембранный цитохром в одной из цепей, открыли аутосомно-рецессивную цитохромb558позитивную форму СПВ (AB+), которая связана с отсутствием второго, цитозольного компонента NADPHоксидазного комплекса [34]. ХГЗ - очень редкое заболевание, поэтому методы генной терапии для него не разработаны, хотя теоретически терапия его возможна методом трансфера гена.
type: dkli00013
ПОИСК НОВЫХ ГЕНОВ РИСКА БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Наши знания о заболеваниях бронхолегочной системы, полученные различными методами исследования в сочетании с молекулярно-генетическими методами поиска генов риска, помогают лучше сориентироваться в патогенезе этих заболеваний. Выделяют следующие механизмы.
---Нарушение протеиназно-антипротеиназного равновесия в легком, в результате чего нарушается структура легочной ткани (через протеолитические энзимы). Прототипом этого довольно частого генетического дефекта протеазно-антипротеазного равновесия является описанный выше ААТдефицит.
---Генетическая регуляция продукции иммуноглобулина Е (IgE) и поиск отвечающих за нее генов. У больных с атопией эта регуляция нарушена, что имеет важное значение в патогенезе БА и других подобных заболеваний.
---Нарушение антимикробных механизмов защиты в легком. Расшифровка генов, отвечающих за это нарушение, приведет к лучшему пониманию патогенеза болезней и новым терапевтическим возможностям.
Внутрилегочное протеиназно-антипротеиназное равновесие. В основе патогенеза ХОБЛ лежит протеиназно-антипротеиназная теория, что было показано в экспериментах на животных и у людей. Известно, что протеиназы в легком обладают сильным поражающим механизмом, если неадекватно ингибируются их ингибиторами антипротеиназами. Так, альфа<sub>1</sub>антитрипсин обеспечивает около 90% антиэластазной активности легкого, а дефицит ААТ - это прототип генетического субтипа ХОБЛ, обусловленного протеиназно-антипротеиназным дисбалансом. В этом случае антагонисты нам известны: это нейтрофильная эластаза и альфа<sub>1</sub>антитрипсин. О физиологических функциях многих других внутрилегочных протеиназ и их ингибиторов известно очень мало. Однако в последние годы изучены некоторые протеиназы и антипротеиназы (табл. 1-3, 1-4).
Таблица 1-3. Протеиназы
Обозначение
Хромосомный регион
Молекулярная масса, kDa
Происхождение
Субстрат
Ингибиторы
Серинэластаза
19p
—
АГН*
Эластин, фибронектин и др.
α 1-Антитрипсин
Протеиназа-3
19р
—
АГН
Эластин
Неизвестный
Азурофилин
19р
—
АГН
Эластин
Неизвестный
Катепсин G
14q 11.2
26
АГН
Эластин
α 1-Антихимотрипсин
Металлоэластаза
—
—
Альвеолярные макрофаги (новый синтез)
Эластин
TIMP** и α 2-макроглобулин
Металлоколлагеназа
—
—
Специфические гранулы нейтрофилов
Коллаген
TIMP и α 1-макроглобулин
* АГН — азурофильные гранулы нейтрофилов.
** TIMP — тканевый ингибитор металлопротеиназ.
Таблица 1-4. Антипротеиназы
Обозначение
Хромосомный регион
Молекулярная масса, kDa
Клетки происхождения
Связывание
α 1-Антитрипсин
14q 31–32
52 (12)
Гепатоциты и альвеолярные макрофаги
Эластазы
α 1-Антихимотрипсин
14q 31–32
68 (26)
Гепатоциты и альвеолярные макрофаги
Катепсин G, химазы тучных клеток
α 2-Макроглобулин
12p 12–13
720
Гепатоциты и альвеолярные макрофаги
Широкий спектр человеческих и бактериальных протеиназ, вирусов, бактерий
Антилейкопротеиназа
—
—
Клетки бронхиального эпителия
Эластаза, катепсин G
Примечание. В скобках указан молекулярный вес углеводных цепей в общем молекулярном весе гликопротеинов.
Активированные нейтрофилы высвобождают кроме серинэластазы еще и катепсин G, протеиназу3 и азурофилин из азурофильных гранул (см. табл. 1-3), и все четыре энзима поражают эластическую структуру легкого [17]. Активированные нейтрофилы аккумулируются в легких курильщиков, так же как у пациентов с ХОБЛ. Кроме этих «эндогенных» протеиназ при инфекциях бронхиального дерева из разрушенных бактерий высвобождаются высокоактивные бактерийспецифические протеиназы, которые принимают участие в разрешении рецидивирующего воспаления при ХОБЛ. Такие защитные функции в легких осуществляются антипротеиназами (см. табл. 1-4).
Благодаря накопленным знаниям с помощью молекулярно-генетических методов были изучены еще два потенциальных гена риска для заболеваний легких - альфа<sub>1</sub>антихимотрипсин (АСТ) и альфа<sub>2</sub>макроглобулин-ген (А2М).
АСТ - это ингибитор серинпротеиназы с до конца не известной физиологической функцией у человека. Это гликопротеин острой фазы, который ингибирует химазу тучных клеток и катепсин G (см. табл. 14). Он кодирован геном, принадлежащим к генной семье альфа<sub>1</sub>антитрипсина в регионе q31 - q32 14й хромосомы и удален от ААТгена не далее чем на 130 базовых пар [49]. По многим причинам его причисляют к потенциально новым генам риска респираторных заболеваний. Он ингибирует продукцию супероксида в нейтрофилах, регулирует их хемотаксис, индуцированный катепсином G, и стимулирует продукцию протеинов острой фазы после связывания с катепсином G [24]. Описан частичный АСТдефицит среди шведского населения (практически у каждого 200го жителя). Гомозиготы этой дефектной аллели пока не найдены, а гетерозигота для дефектной аллели ассоциируется с нарушениями функции внешнего дыхания [39]. У некоторых пациентов с АСТдефицитом были обнаружены сочетания криптогенного цирроза печени с ХОБЛ. Далее с помощью PCRамплификации и прямого секвенирования были обнаружены мутации АСТгена, которые ассоциировались с аномалиями на других протеинах при ХОБЛ. Была установлена точечная мутация Pro229 - Ala, затем Len55Pro молекулярного базиса первых известных дефектов фенотипа альфа<sub>1</sub>антитрипсина. Эта мутация была обнаружена в семье с тяжелым течением ХОБЛ в трех поколениях.
А2М - это ингибитор протеиназ, который появляется в сыворотке человека в высоких концентрациях (8 - 10% от общего количества протеинов). У человека он не является протеином острой фазы, синтезируется в гепатоцитах, альвеолярных макрофагах и фибробластах. А2М ингибирует намного более широкий спектр протеолитических энзимов, чем альфа<sub>1</sub>антитрипсин и АСТ, а именно все протеиназы человеческого и бактериального происхождения [4]. Человеческий А2Ммономер кодируется геном на хромосоме 12, который принадлежит генному комплексу с еще как минимум двумя близкородственными генами [12]. А2Мген крысы и человека клонирован и частично секвенирован, так же как и А2Мрецептор. В то время как уже известны его структура и механизмы влияния in vitro, физиологические функции его in vivo пока не до конца ясны. Он ингибирует практически все протеиназы и рост Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcenscens, Influenzaviren, что соответствует функциям примитивной защитной молекулы и универсального ингибитора протеиназ. Факт его локальной и регулируемой экспрессии в легких благодаря альвеолярным макрофагам позволяет предположить, что при определенных условиях в нем испытывают нужду высвобождаемые через рецептор протеиназы для процесса комплексирования и элиминации. А это, в свою очередь, должно приводить к тому, что хронические воспалительные процессы и структурные изменения в легких, согласно протеиназно-антипротеиназной теории, должны уменьшаться. В настоящее время отсутствуют исследования А2М, подтверждающие конкретные клинические проявления генетического дефекта этого протеина. Имеются данные о больных с ХОБЛ и частичным А2Мдефицитом в комбинации с дефектом субклассов иммуноглобулина G, хотя неясно, причиной или следствием тяжелого состояния больных является А2Мдефицит.
type: dkli00014
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПРОДУКЦИИ ИММУНОГЛОБУЛИНА Е
Атопия - это сложное болезненное состояние, при котором клинической манифестацией являются БА, нейродермит, аллергический ринит с наличием аллергенспецифических IgEантител и повышенного содержания IgE в сыворотке. Хотя генетические элементы атопии до сих пор полностью не изучены, семейная агрегация атопий четко прослежена [51]. Дети с родителями без атопии отягощены в 15% наблюдений, с одним родителем с атопией - в 30%, а с двумя - в 50% случаев. Появление специфических IgE ассоциируется с главным комплексом гистосовместимости (ГКГ). Среди людей с уровнем IgE ниже 60 МЕ/ml (примерно 70% населения) атопия встречается приблизительно в 5%, при уровне 200 - 450 МЕ/ml (10% населения) - в 40%, а выше 450 МЕ/ml - практически в 100% случаев. Общий уровень сывороточного IgE контролируется одним или многими генами, что было доказано в экспериментах на животных. Во многих семьях с атопией проводились анализы сцепления и была доказана тесная связь IgEответа с маркером D11S19 на хромосоме 11q [8]. Для выявления более точной локализации пытаются применять позиционное клонирование.
type: dkli00015
ЗАЩИТНЫЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЛЕГКИХ
Система защиты легких сложна и до сих пор не до конца понятна. Но два аспекта: антимикробные протеины фагоцитов и селективные состояния недостатка иммуноглобулинов - являются очень интересными.