Технология проточной цитометрии имеет ряд преимуществ перед описанными выше методиками.
1. Если изображение в микроскопе является двумерной проекцией клетки, то индикатриса светорассеяния является своего рода одномерным отображением клетки и содержит не меньше информации о характеристиках клетки. В случае каких-либо патологических явлений в клетке можно создавать банк данных индикатрис светорассеяния патологических клеток, точно так же как это уже сделано для микроскопных изображений, и не прибегая к микроскопу в реальном времени производить анализ.
2. Благодаря развиваемым подходам в решении обратной задачи светорассеяния контроль качества работы прибора может осуществляться ежедневным измерением калибровочных сфер определенного размера, а не по крови здорового донора и контрольных измерений калибровочной крови.
3. Использование большого количества информации, содержащейся в индикатрисе светорассеяния, повышает способность проточных цитометров к дифференцировке клеток крови по сравнению с другими гематологическими анализаторами. Благодаря этому в анализах можно исключить использование некоторых химических реагентов.
4. Кинетические измерения индикатрис светорассеяния клеток в процессе реагирования на какое-либо воздействие в сочетании с развиваемой кинетической моделью данного процесса позволяют определять многие дополнительные характеристики клеток. Так, при измерении процесса лизиса и сферизации эритроцитов можно измерить их дополнительные характеристики, такие как площадь, проницаемость и жесткость мембраны.
В настоящее время все проточные цитометры по производительности можно разделить на две группы:
1) простые в использовании и обслуживании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10° (малоугольное прямое рассеяние) и 90°;
2) большие клеточные анализаторы, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров.
Сегодня проточная цитометрия – ведущий метод в клинической иммунологии. В клинической гематологии он может быть использован для решения следующих задач:
1) иммунофенотипирования лимфоцитов, включая определение количества СD4, СD8 клеток и даже ТН1 и ТН2 (по продукции специфических цитокинов);
2) анализа процессов клеточной активации на основе определения маркеров ранней активации: СБ25 (рецептор интерлейки-на-2), СD38, СD69, СD71 (трансферриновый рецептор), СD95 (антиген апоптоза), СD122, анти-HLA-DR;
3) определения маркеров пролиферативной активности клеток иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3);
4) оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями;
5) иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом;
6) анализа клеточного цикла с определением распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия);
7) детекции и наблюдения минимальной резидуальной болезни (МRD);
8) анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1, CD95L, Bcl-2, P53).
В качестве примера устройств, использующих в своей работе методику проточной цитометрии, может послужить проточный цитометр EPICS 4 XL фирмы Beckman Coulter (США).
Проточный цитометр EPICS 4 XL
Общие характеристики
Проточный цитометр EPICS 4 XL – позволяет работать с четырехцветной меткой, т. е. определять в одной пробе сразу 4 параметра с использованием одного источника света – аргонового лазера. Это существенно удешевляет конфигурацию прибора и облегчает задачу оператора. Устраняется необходимость введения временной задержки, устанавливаемой при проведении четырехцветного анализа на приборе с двумя лазерами.
Скорость анализа составляет до 10 000 клеток в секунду, что позволяет получить статистически достоверную информацию о морфологии клеток, их поверхностных антигенах, внутриклеточных ферментах, содержании ДНК и т. д.
Производительность прибора – 90 образцов в ч. Станции Q-Prep и DNA-Prep позволяют автоматизировать пробоподготов-ку для иммунофенотипирования лейкоцитов и ДНК-анализа. Автоматическое устройство Q-Prep проводит приготовление суспензии клеток для анализа за 35 с. Использование безотмывочной технологии лизиса эритроцитов цельной крови позволяет осуществлять подсчет абсолютного количества клеток с помощью референсных частиц.
Прибор имеет встроенную программу контроля качества QC, позволяющую проводить ежедневный мониторинг корректности настроек прибора и качества используемых реагентов, с построением графиков Леви-Дженингса. Проточный цитометр EPICS 4XL является открытой системой, позволяющей работать с реагентами любых фирм, включая отечественные. В стоимость входит: инсталляция прибора, гарантийное обслуживание в течение 12 месяцев, обучение специалистов заказчика правилам эксплуатации, методам работы на приборе и обработке результатов непосредственно на рабочем месте.
Возможности использования прибора для клинико-диагностических целей:
1) анализ субпопуляций клеток периферической крови (иммуно-фенотипирование, мониторинг ВИЧ-инфицированных);
2) анализ пролиферативного статуса клеток (изучение реакции бласттрансформации, определение активационных маркеров клеток);
3) изучение апоптоза и фагоцитоза;
4) типирование лейкозов;
5) типирование клеток в онкологии, в том числе солидных опухолей с использованием тканеспецифических маркеров;
6) определение количества стволовых (СБ34+) клеток;
7) измерение содержания ДНК и анализ плоидности клеток;
8) анализ клеточного цикла;
9) автоматический подсчет относительного и абсолютного количества клеток с использованием референсных частиц;
10) анализ тромбоцитов;
11) подсчет ретикулоцитов;
12) определение внутриклеточных ферментов, интерлейкинов, Са2+, рН;
13) проведение кинетических измерений.
Техническая спецификация прибора:
1) число определяемых параметров – 6;
2) прямое и боковое светорассеяние (FSC, SSC) четыре параметра флуоресценции (FLI – FLIV).
Режим работы:
1) измерение четырех параметров флуоресценции и двух параметров светорассеяния;
2) подсчет абсолютного и относительного количества частиц в ходе измерения;
3) возможность проведения кинетических измерений.
Оптика:
1) аргоновый лазер (488 нм), 15 mW с воздушным охлаждением;
2) детекторы: два полупроводниковых диода на каналах светорассеяния, четыре фотоумножителя на каналах флуоресценции. Фильтры: нейтральный фильтр 1.0 ОD, фильтры пропускания:
525 нм, 575 нм, 620 нм и 675 нм; все оптические фильтры легкодоступны и могут заменяться пользователем.
Проточная кювета:
1) закрытая кварцевая кювета; программа предусматривает возможность автоматической очистки проточной кюветы без прерывания цикла анализа;
2) разрешение на каналах светорассеяния и флуоресценции: 2 % CV (с использованием флуоресцентных калибровочных частиц для всех каналов).
Обработка сигнала:
1) количество детектируемых сигналов: 2 параметра светорассеяния, 4 параметра флуоресценции;
2) один дополнительный усилитель для дискриминации дублетов;
3) полная компенсация на всех четырех каналах флуоресценции, возможность установки значений компенсации на всех каналах без прерывания цикла анализа;
4) усиление сигнала: линейное усиление сигнала в диапазоне 4 декад с возможностью логарифмического преобразования;
5) полное цифровое преобразование сигналов с помощью микропроцессора;
6) цифровое логарифмическое (4 декады) преобразование с компенсацией сигналов флуоресценции;
7) разрешение сигналов: 1024 канала для всех параметров.
Аппараты для анализа гемостаза (коагулометрия)
Исследовать систему гемостаза можно с помощью разнообразных автоматизированных устройств. К таким устройствам относятся:
1) приборы для исследования функции тромбоцитов (тромбоци-тарные агрегометры);
2) приборы для исследования коагуляционной активности плазмы и крови (коагулометры);
3) приборы для оценки физических свойств плазмы крови при коагуляции.
Каждая группа этих устройств имеет свои технические особенности и занимает определенное место в диагностике состояния системы гемостаза.
Агрегометры
Находящийся в основе практически всех выпускаемых тром-боцитарных агрегометров принцип оценки агрегационной функции тромбоцитов основан на измерении оптической плотности обогащенной тромбоцитами плазмы после добавления в нее того или иного индуктора агрегации. Основу этих приборов составляет измерительная камера, состоящая из источника света и фотоприемника, между которыми помещается оптически прозрачная кювета с исследуемыми тромбоцитами. Изменения оптической плотности плазмы с тромбоцитами после добавления к ней агре-ганта и непрерывного перемешивания с помощью встроенной магнитной мешалки регистрируются самописцем или принтером. В дальнейшем полученная кривая агрегации тромбоцитов оценивается по ряду показателей, рассчитываемых автоматически прибором или ручным способом.
В настоящее время на медицинском рынке отечественных приборов для исследования функции тромбоцитов имеются два оптических тромбоцитарных агрегометра – прибор АР-2110 (фирма «СОЛАР») и анализаторы 2231-А и 2301А (НПФ «Био-ла»).
Прибор АР-2110 относится к классическому оптическому агре-гометру, имеющему в своей основе описанный принцип. Прибор позволяет измерять агрегацию клеток в обогащенной тромбоцитами плазме при использовании любых агрегантов. Прибор может работать с достаточно низким количеством клеток и незначительным объемом исследуемой пробы. Важным достоинством прибора является возможность автоматического расчета основных показателей агрегационной функции тромбоцитов (% максимальной агрегации, время максимальной агрегации, скорость агрегации), которые распечатываются вместе с графиком агрегации. Комплектация прибора, включающая компьютер, позволяет вести базу данных, что дает возможность достаточно оперативного сравнения имеющихся результатов. Одной из заявленных функций прибора является возможность подсчета количества тромбоцитов в измерительной камере, однако надо отметить, что использовать этот показатель необходимо с большой осторожностью в силу несовершенства метода измерения, использованного в приборе для этих целей. Наличие одного измерительного канала позволяет проводить не более 4–5 исследований в час.
Разработанный и выпускаемый НПФ «Биола» анализатор агрегации тромбоцитов принципиально отличается от приборов, основанных на исследовании светопропускания плазмы, обогащенной тромбоцитами. Помимо традиционного турбидиметрического метода в приборе реализован метод исследования агрегации тромбоцитов, основанный на анализе флуктуации светопропускания (ФСП-метод), вызванный случайным изменением числа частиц в оптическом канале. По утверждению авторов прибора, применение такого метода значительно повышает чувствительность прибора, особенно при исследовании спонтанной агрегации тромбоцитов, агрегации при воздействии низких концентраций агрегантов, значительно повышает точность измерения концентрации клеток в измерительной камере. Включенный в комплект компьютер и прилагаемое программное обеспечение дают возможность создания базы данных и расчета необходимых показателей агрегации. Дополнительной функцией прибора является возможность определения активности фактора Виллебранда (при наличии соответствующих реактивов).
Коагулометры
Предлагаемые в настоящее время к использованию в клинической лабораторной практике коагулометры относятся к приборам двух типов: механическому и оптическому, в основе деления лежит механизм, предназначенный для регистрации времени образования сгустка фибрина в тестируемой смеси. По точности и воспроизводимости регистрации времени свертывания в бедной тромбоцитами плазме оптические и механические коагулометры не отличаются друг от друга и значимо превосходят мануальные варианты исследования системы гемостаза. При оптической регистрации образование сгустка фиксируется в ответ на изменение оптических свойств тестируемой смеси. При механическом типе регистрирующее устройство фиксирует изменение скорости перемешивания тестируемой смеси (вследствие изменения вязкости тестируемой смеси) шариком или каким-либо другим устройством для перемешивания. Большинство механических коагулометров – шариковые. Неоспоримым преимуществом механических коагу-лометров является возможность регистрации коагуляции цельной крови, что остается актуальным в педиатрической практике и при скрининговом обследовании. Однако при регистрации времени свертывания в крови ряда больных точность такого исследования несколько ниже, чем при определении времени свертывания в плазме, так как оказывает влияние показатель гематокрита (время свертывания у больного с плеторическим синдромом будет отличаться от времени свертывания у больного с анемией). Весьма удобно, что почти на всех коагулометрах с оптическим типом регистрации старт времени коагуляции происходит автоматически в ответ на изменение оптической плотности после добавления стартового реагента (например, стартовым реагентом в тест-системе АПТВ является хлорид кальция, т. е. последний, добавляемый в тестируемую смесь реагент).
К совмещенным устройствам следует отнести редкие экземпляры коагулометров, в которых предусмотрена возможность выбора оптического или механического типа регистрации (т. е. в одном приборе совмещены оптический и механический принципы регистрации). К совмещенным следует отнести отечественный Ми-нилаб-701.
Различают одноканальные, двухканальные, четырехканаль-ные и многоканальные коагулометры. Как правило, число каналов не бывает более десяти. Производительность одноканального коагулометра низка. Опытный лаборант, используя мануальную технику, выполнит большинство коагуляционных тестов в 2–3 раза быстрее, чем на одноканальном коагулометре. У коагуло-метров, имеющих более двух регистрирующих каналов, число каналов, как правило, кратное, так как большинство производителей предусматривают возможность дублирующих определений и вычисление коэффициента вариации между двумя каналами.
Число каналов автоматического коагулометра для его производительности не имеет существенного значения, поскольку производительность автоматического коагулометра, как правило, выше многоканальных.
В представленной таблице показано оптимальное число регистрирующих каналов коагулометра без автоматических функций в зависимости от числа коагуляционных тестов, выполняемых в течение рабочего дня в клинико-диагностической лаборатории (см. табл. 4).
Таблица 4 Виды коагуляторов
Некоторые коагулометры совмещены с фотометрами для выполнения амидолитических и/или иммунологических тестов. Такие коагулометры называют комбинированными. Большинство же коагулометров не способны выполнять амидолитические и/или иммунологические тесты.
Автоматическим коагулометром следует называть коагуло-метр с высокой производительностью, в котором предусмотрена программа, полностью контролирующая добавление реагентов (и позволяющая изменять объемы дозируемых реагентов), а также автоматическую подачу образцов плазмы для исследования, наличие программируемого алгоритма, позволяющего выполнять разные тесты для разных образцов плазмы, автоматическую регистрацию и запоминание результатов исследования, с возможностью последующей обработки этих результатов.
Полуавтоматическими следует называть коагулометры, имеющие программируемый модуль, позволяющий автоматически добавлять реагенты в кювету для регистрации коагуляции (но не позволяющий добавлять исследуемую плазму в кювету). Кроме того, такие коагулометры имеют автоматическую регистрацию и запоминание результатов исследования, с возможностью обработки результатов.