Аппараты для иммуноферментного анализа (ИФА)
Любое вещество, обладающее свойствами антигена, полноценного или неполноценного (гаптена), можно количественно определить с применением иммуноферментного анализа (ИФА). Для проведения ИФА необходимо иметь очищенный антиген, специфическое для этого антигена антитело, фермент в качестве метки для антигена или антитела и средство (устройство) для регистрации активности фермента.
Реакцию ИФА можно проводить двояко. В первом случае из антигена, находящегося в тестируемом образце, и меченого антитела, добавленного в концентрации, превышающей концентрацию антигена, образуется комплекс антиген-меченое антитело. Количественно проанализировать такую реакцию можно по образованию комплекса антиген-меченое антитело, определяемого с помощью ферментной метки, или по меченому антителу, оставшемуся в несвязанном состоянии. Это неконкурентный вариант ИФА.
Во втором варианте лимитирующим субстратом является антитело. Меченый антиген при добавлении в анализируемый образец в известной концентрации связывается с антителом, образуя комплекс меченый антиген-антитело. В этой реакции меченый антиген будет конкурировать с немеченым антигеном, содержащимся в образце. Концентрация меченый антиген-антитело будет обратно пропорциональна концентрации антигена. Таким образом по заранее известной концентрации меченого антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена. Это конкурентный вариант ИФА. В обоих вариантах ИФА надо решить важную задачу – отделить связанную фракцию меченого реагента от несвя-завшегося, свободного реагента, чтобы определить долю специфического связывания.
Наборы иммунохимических реагентов для определения антигенов называются диагностикумами. Для их создания необходимо решить задачи получения антигена, антитела, комплекса антигена или антитела с ферментом, наладить регистрацию иммунохимиче-ской реакции по активности фермента, использованного в качестве метки. Кроме ферментов, в качестве меток для антигенов используют радиоактивные и флуоресцирующие соединения, такие реакции соответственно называются радиоиммунным и флуорес-центноиммунным анализом (РИА и ФИА). Предпочтением пользуется ИФА, поскольку он не требует сложной измерительной аппаратуры и применения радиоактивных соединений.
Иммунохимический анализ не ограничивается ИФА, РИА и ФИА, которые основаны на прямом взаимодействии антигена с антителом. Имеются другие методы обнаружения и количественного определения антигенов в зависимости от их физического состояния при взаимодействии с антителами. Если антиген расположен на поверхности клеток, то антитела вызовут слипание (агглютинацию) таких клеток. Этот принцип лежит в основе определения групп крови: склеивание эритроцитов при взаимодействии поверхностных антигенов с добавленными антителами – гемагглютинация. Антитела при добавлении в определенном соотношении к раствору макромолекулярных антигенов вызывают их преципитацию – образование крупных, визуально обнаруживаемых агрегатов из молекул антигена, связанных антителами. Во время проведения реакции преципитации в гелях возникают линии преципитации при образовании иммунных комплексов антиген-антитело, по форме этих линий можно судить о числе и иммунологическом родстве антигенов. Для идентификации белков широко применяется методика иммуноблоттинга: сначала смесь белков разделяют с помощью электрофореза в геле, затем на гель накладывают нитроцеллюлозную мембрану и на нее электрофо-ретически переносят (подвергают электроблоттингу) разделенные белки, которые идентифицируют посредством меченых антител. Меченые антитела широко используют в исследовании локализации компонентов клеток и тканей – это методы имму-ноцито– и иммуногистохимии. Клетки, меченные флуоресцирующими антителами, можно отделить от немеченых клеток – метод проточной цитофлуориметрии. Хроматографические колонки с сорбентом, с которым ковалентно связан антиген (или антитело), используются в аффинной хроматографии – отделении соответствующего антитела (или антигена) из смесей в результате образования иммунных комплексов. Еще одно применение иммунохи-мического анализа – иммуносенсоры: пьезокристалл, покрытый антигеном (антителом), в результате связывания антител (антигена) увеличивает свою массу и меняет частоту резонансных колебаний в переменном электрическом поле, что позволяет регистрировать изменение массы пьезоэлектрика порядка 10–12 г.
Таким образом, ИФА – это лишь один из способов определения антигенов, получивший широкое практическое распространение благодаря возможности количественных определений, высокой чувствительности и коммерческой доступности. В научно-исследовательской работе эти возможности иммунохимических методов всегда используются вместе с ИФА и даже с применением одних и тех же реагентов.
Возможности увеличения чувствительности ИФА ограничиваются фоном анализируемого соединения (т. е. его наличием не только в анализируемом образце, но и в используемых реактивах и растворителях), субстратной специфичностью фермента и аффинностью антител. К ограничениям ИФА относится также наличие в тестируемых образцах кофакторов, ингибиторов и стимуляторов активности ферментов. Еще один недостаток – ИФА не позволяет различать нативные белки и их биологически неактивные фрагменты, сохранившие антигенные детерминанты. Помехой для ИФА может быть изменение каталитической активности фермента при его конъюгировании с антигеном. Ограничением ИФА является его применимость лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифические антитела.
Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от нескольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Поэтому сегодня ИФА находит широкое применение не только в здравоохранении, но и в различных областях сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной деятельности и научно-исследовательской работе.
Любое заболевание человека и животных можно быстро и точно диагностировать путем идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при его патологических состояниях (рак, сердечно-сосудистые и эндокринные заболевания). Диспансеризация населения, эпидемиологические обследования, выявление отравлений, наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в тканях, вирусных заболеваний растений, определение антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений при отборе активных штаммов-продуцентов в промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови на отсутствие вирусов-возбудителей СПИДа и гепатита В – это лишь небольшой перечень практического применения ИФА. Современные фундаментальные исследования в биохимии, клеточной физиологии и иммунологии, микробиологии, вирусологии, онкологии трудно представить без ИФА. Реагенты для проведения ИФА сегодня стали коммерческими продуктами и могут быть приобретены по каталогам известных фирм.
Автоматизированные ИФА-анализаторы представляют собой модульную систему и состоят из автоматического дозатора образцов, сканера штрих-кода пробирок, промывочного блока, инкубатора, устройства для считывания оптической плотности частиц, блока для обработки результатов, представленного, как правило, персональным компьютером с соответствующим программным обеспечением.
Дозатор образцов используется для раскапывания образцов из пробирок на любые форматы исследуемых носителей – микропланшеты, пробирки, специальные картриджи, а также дозирования реактивов.
Образцы могут находиться в пробирках различных размеров и диаметров в зависимости от конструкции прибора. Многие ИФА-анализаторы оснащены датчиком детекции уровня жидкости образцов и реактивов и наличия сгустков, учитывая это, они могут использовать первичные пробирки с осажденным (но не удаленным) сгустком и эритромассой.
Процесс дозирования образцов и реактивов строится обычно таким образом, что они дозируются за один проход в несколько планшетов (рабочий стол вмещает одновременно от 1 до 5 планшет и от 2 до 14 реактивов). Например, если образцы исследуются на ВИЧ, гепатиты В и С, то за один проход они дозируются во все три планшета. В сочетании с использованием до 12 наконечников такая технология обеспечивает скорость дозирования 96 образцов (вместе с чтением штрих-кода) и реактивов на 4 планшета (ВИЧ, гепатит В и С, сифилис) в среднем за 15–20 мин.
Встроенный сканер штрих-кода пробирок обеспечивает идентификацию образцов, что является основой последующей автоматизации обработки информации. Вместе со сканерами штрих-кода микропланшетов и реактивов это обеспечивает:
1) автоматическую идентификацию образцов и реактивов, устраняет возможные ошибки регистрации и загрузки реактивов;
2) автоматизирует процесс последующей обработки информации и выдачи результатов по конкретному образцу;
3) позволяет контролировать и регистрировать процесс обработки каждого образца (и соответственно лунки планшета), обеспечивая надежность результатов.
Модуль промывки (вошер) оснащен многоканальной промывочной головкой с функцией детекции уровня жидкости в лунках при промывке, что обеспечивает дополнительный контроль за качеством промывки и предотвращает возникновение ложных результатов.
Качество промывки обеспечивает отсутствие кросс-контаминации, а многократное применение наконечников позволяет резко снижать себестоимость исследования. При этом сохраняется возможность в особо критических приложениях использовать наконечники в качестве одноразовых.
Затем микропланшеты с дозированными образцами и реактивами переносятся в инкубатор. Инкубация планшетов осуществляется в ячейках инкубации с индивидуально контролируемой температурой, конструкция которых обеспечивает отсутствие испарения реакционной смеси во время инкубации.
Считывание результата выполняется с помощью многоканального фотометра в моно– или бихроматическом режимах. Фотометр оснащается несколькими светофильтрами, работающими в диапазоне длин волн 340–850 нм.
Полученные данные оптической плотности обрабатываются на ПК врача-лаборанта с помощью программ в соответствии с методикой интерпретации результатов, изложенной в инструкции к используемым тест-системам. Полученные после интерпретации данные сохраняются в базе данных ПК, распечатываются в требуемом формате отчетности (настраивается пользователем) и передаются в информационную сеть лаборатории.
Производительность, помимо конструктивных особенностей комплекса, определяется также используемыми тест-системами и их сочетанием, конфигурацией комплекса, длительностью работы оборудования и потому является достаточно индивидуальным параметром.
Аппараты экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)
Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) – это оплодотворение вне организма с последующим переносом развивающейся оплодотворенной яйцеклетки (эмбриона) в полость матки. Основными показаниями к процедуре ЭКО являются:
1) нарушения функции маточных труб;
2) снижение качества спермы;
3) некоторые формы эндометриоза;
4) патология слизи цервикального канала;
5) труднообъяснимое бесплодие (возможно, связанное с тем, что эмбрион не может покинуть блестящую оболочку, имплантироваться и развиваться) после проведенного полного клинического исследования, включая гормональное, эндоскопическое, иммунологическое.
Помимо причины бесплодия, большую роль играют возраст женщины и длительность бесплодия. Эффективность лечения определяется различными факторами.
Процедуру ЭКО можно разделить на несколько этапов лечения: отбор пациенток по показаниям; контроль за созреванием фолликулов (трансвагинальная эхография, исследование 17-эст-радиолы крови) и стимуляция созревания яйцеклеток, забор яйцеклеток (пункция), собственно экстракорпоральное оплодотворение (предынкубация, оплодотворение in vitro, культивирование, криоконсервация), перенос эмбрионов в полость матки (эмбрио-трансплантация), контроль развития беременности и лечение после переноса.
Необходимо отметить, что существуют условия проведения эмбриотрансплантации, к ним относятся:
1) сохраненная в полном объеме функциональная способность матки к имплантации и вынашиванию беременности;
2) отсутствие противопоказаний к беременности и родам (соматические, психические, генетические заболевания);
3) сохраненная способность яичников к адекватному ответу на стимуляцию овуляции – экзогенную и эндогенную;
4) отсутствие новообразований, воспалительных и анатомических изменений в органах малого таза. Эти условия должны быть соблюдены еще на этапе отбора пациенток.
Также при подборе больных следует обратить внимание на следующие факторы.
1. Возраст родителей. У женщин в возрасте 40 лет в 23 раза чаще рождаются дети с синдромом Дауна (Simpson, 1979).
2. Наличие доказанной способности к зачатию.
3. Наличие нарушений метаболизма, таких как сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит и дефицит антитрипсина, предрасполагающих к появлению анэуплоидии у плода.
4. Наличие анэуплоидии. Если один из родителей является анэуплоидом, то увеличивается риск рождения детей с хромосомными нарушениями.
Все супружеские пары, отобранные для лечения по методу ЭКО, должны понимать его суть, знать о возможном риске и дать продуманное согласие на лечение.
За 2 или 3 месяца до начала активного лечения по методу ЭКО следует произвести полное исследование спермы, включающее бактериологическое исследование и посев, одновременно с исследованием влагалищных и цервикальных мазков с целью исключения патологии, вызванной гонококками, микоплазмой, грибами, трихомонадами и другими возбудителями. Лечение инфекционных заболеваний половых органов предпринимается с целью предупреждения заражения культуры, в которой производится оплодотворение, и осложнений после переноса эмбриона. Помимо этого, рекомендуется сделать мазки по Папаниколау с целью исключения рака шейки матки и поражения половых органов вирусом герпеса.
Во время предовуляторной фазы исследовательского цикла берут кровь для приготовления эмбриокультуры и проведения серологических исследований на токсоплазмоз, краснуху, цитоме-галовирусы и вирусы герпеса, гепатит В и сифилис. Также следует исследовать кровь на хромосомы для идентификации лиц с повышенным риском воспроизводства анэуплоидных гамет. Сыворотку крови следует исследовать на предмет выявления ан-тиспермальных антител и антител на блестящей оболочке.
На этапе предварительного обследования необходимо измерить длину цервикального канала и полости матки с помощью маточного зонда, учитывая последующий перенос эмбриона катетером.
Хотя существует мнение, что при естественном цикле шансы на успех достаточно велики, большинство специалистов считают, что при «стимулированном» цикле частота наступления беременности выше. Хорошо известно, что с увеличением числа трансплантируемых эмбрионов возрастает вероятность имплантации. Но отмечено, что частота многоплодной беременности также возрастает с увеличением числа внесенных эмбрионов. Поэтому рекомендовано введение не более трех эмбрионов. В целях получения наибольшего количества яйцеклеток широко и успешно применяют методы гормональной стимуляции овуляции (см. табл. 5).
Главное отличие стимулированного цикла при ЭКО от естественного заключается в том, что под влиянием гормонов созревает не одна, а несколько яйцеклеток. Затем созревшие яйцеклетки извлекают из яичников, чтобы оплодотворить вне организма. Необходимость получения нескольких яйцеклеток обусловлена фактом, что не каждая яйцеклетка может быть оплодотворена, а также не все эмбрионы имеют одинаковые шансы на имплантацию. Наличие нескольких эмбрионов позволяет выбрать для переноса те из них, у которых вероятность имплантации наилучшая. Чтобы избежать осложнений и при этом получить максимальное количество зрелых яйцеклеток, гормональная терапия подбирается индивидуально.