Первый шаг лечения направлен на оптимальную подготовку организма к стимуляции гормонами. Регуляция менструального цикла проводится таким образом, чтобы временем овуляции и забора яйцеклеток можно было управлять. Это достигается с помощью медикаментов, которые подавляют продукцию собственных гормонов, стимулирующих работу яичников (ФСГ и ЛГ), – так называемая даунрегуляция. Медикаменты, используемые в фазе даунрегуляции, называются агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (агонисты ГнРГ) и воздействуют на ту часть мозга, которая ответственна за выброс гормонов ФСГ и ЛГ. Даунрегуля-ция используется при проведении длинного протокола стимуляции и назначается с 19-22-го дня цикла. Препараты могут иметь различные названия и применяться в виде ежедневных инъекций, назального спрея или депо. Благодаря этой подготовке в дальнейшем улучшается возможность регулировать фазу стимуляции.
При проведении короткого протокола необходимы антагонисты ГнРГ, которые также применяются для подавления продукции собственных гормонов. Их оборот начинается только в фазе стимуляции, т. е. от начала менструации. Благодаря этому общее время лечения уменьшается и снижается риск появления симптомов гипоэстрогении.
Решение о выборе протокола принимает врач в зависимости от исходных данных пациентов.
Для стимуляции созревания яйцеклеток могут быть использованы различные препараты, которые соответствуют естественному гормональному циклу. Они различаются по технологии изготовления.
НМв (человеческий менопаузальный гонадотропин) получают из мочи женщин, находящихся в постменопаузе (климактерическом периоде). НМв содержит в одинаковой мере ФСГ и ЛГ.
Рекомбинантный ФСГ производят с помощью биологических технологий. Это чистый белок, полностью идентичный естественному гормону. Поэтому рекомбинантные препараты часто лучше переносятся пациентами.
В мочевых препаратах чистота и содержание ФСГ могут существенно колебаться, а также они чаще вызывают аллергию. Однако вероятность наступления беременности после стимуляции рекомбинантным ФСГ или мочевыми препаратами существенно не различается.
Стимуляция гонадотропинами (ФСГ) начинается, как правило, через 14 дней после начала даунрегуляции (длинный протокол) либо в течение первых трех дней цикла – короткий протокол (1-й день цикла = 1-й день менструации). Лечение гонадотропина-ми длится в среднем 11–13 дней. В течение этого периода в одно и то же время суток осуществляются внутрикожные (или внутримышечные) инъекции определенного количества гормона. Если для подавления собственных гормонов используется антагонист ГнРГ, его введение начинается с 5-7-го дня стимуляции.
Во время стимуляции проводится ультразвуковое наблюдение. Этот мониторинг служит для контроля за количеством и размерами фолликулов, а также толщиной эндометрия. Таким образом можно выбрать оптимальный момент для начала овуляции и пункции фолликулов. Также благодаря наблюдению удается снизить риск гиперстимуляции.
Овуляция и забор яйцеклетки
Когда созревание яйцеклеток в фолликулах подходит к концу, необходимо отменить введение ФСГ. Теперь с помощью другого гормона – ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) – яйцеклетки подготавливаются к овуляции. ХГЧ берет на себя роль ЛГ, которую последний выполняет в естественном цикле. ХГЧ получают из мочи беременных женщин, а в последнее время в чистом виде с помощью биотехнологий. Спустя около 36 ч после введения ХГЧ, незадолго до овуляции, происходит забор яйцеклеток из фолликулов.
Существует несколько методов забора яйцеклеток для оплодотворения. Ооциты могут быть получены при лапароскопии, мини-лапаротомии или путем аспирации фолликулов под контролем УЗИ.
Методика лапароскопии
Премедикация и общая анестезия проводятся так же, как и при обычной лапароскопии. В брюшную полость вводится газовая смесь, содержащая 5 % СО, 5 % О, 90 % N. Аспирацию предовуля-торного фолликула производят длинной иглой (24 см), изогнутой под углом 45° с наружным диаметром 1,3 мм и просветом в 1,1 мм. Игла проводится через канюлю, введенную в брюшную полость в точке, расположенной на середине между лонным сочленением и пупком по средней линии живота.
Для аспирации фолликула применяется пониженное давление. Точка пункции фолликула должна располагаться в неваскуляризо-ванной области или примыкать к стромальным элементам яичника для того, чтобы предотвратить утечку фолликулярной жидкости из переполненного фолликула. Собранная фолликулярная жидкость может быть сразу исследована на содержание в ней яйцеклетки.
Забор яйцеклеток до момента овуляции необходим, так как после овуляции яйцеклетка попадает в маточную трубу или брюшную полость, где становится практически недоступной.
Предовуляторная яйцеклетка человека может быть обнаружена невооруженным глазом по наличию в аспирате массивных и клейких хлопьев размером до 5 мм и более. Однако важно убедиться, что яйцеклетка действительно находится в этих хлопьях путем их просмотра в препарационном микроскопе. Яйцеклетка 2 раза обмывается оплодотворяющей средой, которая удаляет большую часть фолликулярной жидкости. Затем она переносится в капле равновесной оплодотворяющей среды под стерильное парафиновое масло. В качестве оплодотворяющей среды применяется раствор тироде, содержащий пируват, альбумин, антибиотики.
Оплодотворение и перенос эмбрионов
Для оплодотворения яйцеклеток в день пункции необходимо наличие свежей спермы супруга. Сперму получают путем мастурбации. В редких случаях супруг сдает сперму заранее и она хранится в лаборатории при очень низкой температуре (криоконсервация спермы). Сперму с учетом ее разжижения при комнатной температуре разводят в 2 смывах оплодотворяющей среды. Удаление семенной плазмы производят следующим образом. Небольшое количество спермы разводят в 4-кратном объеме оплодотворяющей среды, затем суспензию сперматозоидов центрифугируют, удаляют надсадочную жидкость, ресуспензируют комочек сперматозоидов и повторяют эту процедуру. Полученный таким образом комочек сперматозоидов вновь ресуспензируют, определяют их концентрацию и подвижность и доводят эти параметры до значений, которые считаются стандартными для процедуры оплодотворения яйцеклетки.
Затем сперматозоиды переносят в специальный термостат, где уже находятся яйцеклетки. При осеменении на 1 яйцеклетку добавляют 200 000–300 000 сперматозоидов.
Процесс культивирования происходит в специальной среде с абсолютной влажностью, при температуре 37 °C в растворе с рН, равным приблизительно 7,6, в атмосфере, содержащей 5 % СО2, 5 % О2 и 90 % Яйцеклетку оставляют в суспензии сперматозоидов на 6-18 ч.
Следующие морфологические особенности яйцеклетки, большинство которых выявляют с помощью микроскопа, могут определить признаки произошедшего оплодотворения:
1) выталкивание второго полярного тельца в желточное пространство;
2) цитоплазма яйцеклетки сжимается, отступая от оболочки;
3) в ранней стадии оплодотворения в цитоплазме яйцеклетки может наблюдаться головка, срединный сегмент и хвост сперматозоида. Эти признаки могут отмечаться только при сильном увеличении, используя фазово-контрастную методику;
4) в более поздние стадии (около 12–18 ч после инсеменации) в цитоплазме могут быть мужские и женские проядра.
Деление зиготы
После завершения периода инсеменации яйцеклетку переносят в равновесную каплю среды по парафиновое масло. Среда состоит из свежеприготовленного раствора Ham F10 с добавлением 15 % сыворотки крови больной. Растущий эмбрион человека культивируется при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5 % СО2, 5 % О2 и 90 % N2 в среде с рН, равным 7,3.
О нормальном развитии эмбриона в культуре свидетельствует появление делящихся клеток приблизительно одинакового размера и формы, которые равномерно заполняют большую часть пространства в пределах блестящей оболочки. Деление клеток должно быть нарастающим и наблюдаться во время четко определенного времени. Так, эмбрион должен содержать 2 клетки через 35–46 ч, 4 клетки через 51–63 ч, 8 клеток через 68–86 ч после инсемена-ции, а стадия 16 клеток должна быть достигнута в пределах 84– 112 ч после оплодотворения.
Если клетки развивающегося эмбриона имеют неправильную форму или отходят от блестящей оболочки, или же скорость деления клеток существенно отличается от описанной выше, то развитие эмбриона считается патологическим и он непригоден для переноса в полость матки.
Оставшиеся эмбрионы хорошего качества могут быть сохранены при очень низкой температуре для дальнейших попыток (криоконсервация эмбрионов).
Так как в большинстве случаев эмбрион переносится в полость матки на стадии 8 или 16 клеток, то это означает, что эмбрион человека перед имплантацией должен содержаться в культуре в течение 3–4 суток.
Эмбрион в 0,05 мл культуральной среды осторожно засасывается в стерильный катетер диаметром 1,4 мм. Затем катетер проводится через цервикальный канал в полость матки, где в области дна эмбрион высвобождается из катетера. С целью облегчения проведения этой процедуры катетер следует разместить по длине для контроля положения его конца в полости матки. Помимо этого, следует очень аккуратно манипулировать шейкой матки во избежание сокращения мышц матки. Если в полость матки переносят более двух эмбрионов, существенно повышается риск многоплодной беременности. После переноса эмбрионов в полость матки назначают препараты прогестерона и эстрогены, чтобы поддержать имплантацию эмбриона. В этом случае говорят о поддержке лютеино-вой фазы.
Контроль подтверждения беременности
Для контроля ранних сроков развивающейся беременности проводят динамическое определение – субъединицы хориониче-ского гонадотропина, которое помогает определить беременность с 7-9-го дня после ТЭ. При наступлении беременности за женщинами ведется постоянное наблюдение методами, принятыми для ведения беременности и родов женщин с отягощенным акушерским анамнезом.
Должно производиться серийное ультразвуковое обследование плода. На 1-7-й неделе беременности определяются положение амниона и сердечная деятельность плода. После этого контроль должен производиться на 20, 28 неделе и далее с целью определения степени развития плода. На основании полученной информации можно наблюдать характеристики роста плода на протяжении беременности и выявить определенную патологию развития скелета. Пункцию амниона можно производить приблизительно на 16-й неделе беременности. Таким образом может быть определен кариотип и уровень фетопротеинов, определяющий наличие дефектов развития нервной трубки плода.
ИКСИ (инъекция сперматозоида в яйцеклетку) – это особая форма ЭКО, применяемая при тяжелых формах мужского бесплодия. При низком содержании подвижных сперматозоидов в эякуляте – тяжелой олигозооспермии и/или астенозооспермии, и/или тератозооспермии вероятность оплодотворения очень мала. Поэтому основной задачей ИКСИ является осуществление проникновения сперматозоида через оболочку яйцеклетки – оплодотворение. Для успешного проведения ИКСИ достаточно наличия в эякуляте единичных живых сперматозоидов.
Показанием к ИКСИ является также тяжелое аутоиммунное бесплодие у мужчин при титре антиспермальных антител в сперме более 50 %. В этом случае, как правило, количество подвижных сперматозоидов существенно снижено.
ИКСИ применяется также при недостаточном оплодотворении в предыдущих попытках (оплодотворено менее 50 %), при малом количестве яйцеклеток.
Под инвертированным микроскопом сперматозоид втягивают в очень тонкую стеклянную иглу и инъецируют непосредственно в яйцеклетку.
Такая микроинъекция имитирует естественный процесс проникновения сперматозоида в яйцеклетку. Эта процедура не оказывает отрицательного влияния на слияние пронуклеусов яйцеклетки и сперматозоида. Если оплодотворение и деление произошло, как и при процедуре ЭКО, спустя 2–5 дней эмбрион переносят в полость матки.
Как только оплодотворение произошло, качество эмбрионов и вероятность наступления беременности после ИКСИ не отличаются от таковых после традиционного ЭКО.
Для осуществления ЭКО необходима рабочая станция, в состав которой входят: ламинарные шкафы, термостаты и подогреваемые поверхности, антивибрационный стол, криоконсерватор, СО2 инкубаторы, стереомикроскопы.
Ламинарные шкафы и рабочие станции предназначены специально для работы с ооцитами, эмбрионами и спермой в лабораториях ЭКО. Они обеспечивают циркуляцию ламинарного потока воздуха для предотвращения контаминации, класс I биологической защиты (защита материала), имеют встроенную увлажнительную систему и большой выбор опций для формирования рабочей станции ЭКО нужной конфигурации.
Антивибрационные столы обеспечивают оптимальные условия для проведения процедур ЭКО и ИКСИ.
Термостаты и подогреваемый столы необходимы для культивирования и транспортировки половых клеток и эмбрионов в пределах лаборатории в условиях постоянной температуры, как правило, это около 37 °C.
Криоконсерватор необходим для криоконсервации спермы, яйцеклеток и эмбрионов. Имеет модульную структуру и состоит из контроллера температуры, криокамеры и криованны. Такие устройства поддерживают диапазон температур от -120 до +40 °C, имеют несколько предустановленных программ, предупреждающий сигнал при изменении температуры более чем на 1,5 °C, минимальный температурный шаг 0,04 °C, соединение с компьютером.
СО2-инкубаторы могут быть настольными и портативными разнообразных размеров. Инкубаторы имеют несколько изолированных камер для биоматериала, диапазон поддерживаемой температуры зависит от конструкции прибора, производителя и поставленных целей. Портативные СО2 инкубаторы имеют встроенную батарею, обеспечивающую бесперебойную работу аппарата при транспортировке образцов, систему тревог по температуре и заряду батареи.
Также для нормальной работы ЭКО-лаборатории необходимы расходные материалы: среды для культивирования, для промывки спермы, пробирки, чашки Петри, 4-луночные планшеты, пипетки, криопробирки, криосоломки, микропипетки для ИКСИ, наконечники для стриппера для очистки ооцитов, наборы для пункций, катетеры для переноса, фильтры для шприцов, стерильное минеральное масло.
Глава 5
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ИНСТРУМЕНТЫ
Щелевые лампы и офтальмоскопы
Одним из методов исследования зрительного нерва, сосудистой оболочки и сетчатки является офтальмоскопия, существует несколько видов и методов: офтальмоскопия в обратном виде, непрямая бинокулярная, офтальмоскопия в прямом виде и офталь-мохромоскопия. Глазное дно, как правило, исследуют в темном помещении и при широком зрачке, для чего проводят атропини-зацию, противопоказана данная процедура лицам, страдающим глаукомой и с атрофией сфинктера зрачка. При офтальмоскопии оценивают диск зрительного нерва: его форму, цвет (в норме желтовато-розовый), границы. В центре диска имеется углубление – физиологическая экскавация, это место перегиба волокон зрительного нерва. Дают оценку артериям и венам: калибр, извитость, склерозированность.
Световую щель фокусируют на ту ткань, которая подлежит осмотру. Тонкий большой силы световой пучок позволяет получить оптический срез на полупрозрачных и прозрачных тканях. Так, при исследовании роговицы можно видеть ее толщину, неоднородность оптической плотности разных ее слоев, вид и ход нервных веточек, мельчайшие отложения на задней поверхности роговицы. Также можно исследовать ток крови в краевой петлистой сосудистой сети и сосудах коньюнктивы. Отчетливо видны повреждения хрусталика. Можно применять щелевые лампы в сочетании с гониоскопом для исследования угла передней камеры глаза.
Щелевая лампа состоит из осветителя, или собственно щелевой лампы, бинокулярного микроскопа, лицевого установа, координатного и инструментального столиков. Осветитель и микроскоп смонтированы вместе на координатном столике, что обеспечивает в процессе работы их совместное перемещение в разные стороны. В основной части прибора – осветителе – источником света служит электрическая лампа СЦ-69 (6) (6В, 25Вт), питающаяся от общей осветительной сети напряжением 127 или 220 В через понижающий трансформатор. Цоколь лампы впаян в специальную центрирующую обойму, которая помещается в патроне в таком положении, что нить накала лампы располагается вдоль вертикальной осветительной щели. Это обеспечивает наибольшую освещенность вертикального изображения щели. Патрон в корпусе осветителя закрепляется зажимной гайкой. Несколько выше лампы находится конденсор в оправе, состоящий из двух линз, обеспечивающих концентрацию светового пучка, излучаемого лампой. Над конденсором расположен механизм щели.