где λ длина волны света; n показатель преломления иммерсионной среды; α апертурный угол (максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы).
Выражение NА = n sin α называют числовой апертурой.
Согласно формуле Гельмгольца, разрешение объектива микроскопа зависит от длины волны облучающего света и пропорционально числовой апертуре. Повысить разрешение также можно с помощью увеличения коэффициента преломления иммерсионной среды. Поскольку невозможно неограниченно уменьшать длину волны облучающего света и увеличивать числовую апертуру объектива, существует разрешающий предел около 200 нм. Однако есть возможность улучшить качество изображения за счет увеличения контраста. Если установить диаметр конфокальной диафрагмы равным диаметру центрального пятна дифракционной картины точечного объекта (диску Эйри), то можно избежать попадания в объектив света от дифракционных колец. Применяя такую технологию, можно повысить контрастность примерно в 1,4 раза по сравнению с обычными микроскопами, а это приведет к заметному улучшению качества изображения. Аксиальное разрешение конфокального микроскопа также зависит от диаметра диафрагмы. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньше толщина слоя, с которого снимается сигнал, следовательно, лучше аксиальное разрешение (свет из соседних точек, находящихся вне фокальной плоскости, задерживается диафрагмой). Величина конфокальной диафрагмы, равная размеру диска Эйри, рассчитывается программой, управляющей конфокальным микроскопом, для каждого сочетания объектива и используемых фильтров (1 Airyunit). Она легко может быть задана без дополнительных вычислений.
С более подробным описанием принципиальной схемы конфокального микроскопа и порядком работы его модулей можно ознакомиться в работах Э. И. Лежнева [и др.] (2001), Г. И. Штейна (2007); R. Y. Tsien [et al.] (2006); B. J. Nair [et al.] (2012).
Как указывалось выше, в конфокальной лазерной микроскопии изображение всего образца получают путем сканирования. Скорость поточечного сканирования ограничивает скорость работы микроскопа в целом и делает невозможным наблюдение за быстротекущими процессами. Чтобы избежать этого ограничения, на практике используют не одиночную диафрагму, а массив диафрагм и детекторов. Такие массивы размещают на диске Нипкова. Это устройство, изобретенное Паулем Нипковым в 1884 г., представляет собой вращающийся диск из непрозрачного материала с нанесенными на нем отверстиями одинакового диаметра, расположенными по спирали в один оборот, начиная от наружного края диска. Наблюдая объект через сектор быстро вращающегося диска Нипкова, можно заметить, что происходит его построчное сканирование. При более высокой скорости вращения объект можно увидеть целиком (Феофанов А. В., 2007).
Современный аналог диска Нипкова содержит 20 тыс. отверстий, на которых лазерный луч фокусируется при помощи дополнительного диска с микролинзами. При вращении такого двойного диска достигается считывание до 360 кадров в секунду. Однако стоит отметить, что диаметры отверстий и расстояния между ними на диске фиксированы и подбираются для конкретного объектива, следовательно, смена последнего требует замены диска.
Сегодня на смену вращающимся дискам Нипкова приходят их твердотельные неподвижные аналоги цифровые микрозеркальные устройства (digital micromirror device, DMD). Эти устройства представляют собой массивы микрозеркал, которые соответствуют пикселям в проецируемом изображении и, отклоняясь в ту или другую сторону, управляют прохождением света. В конфокальной микроскопии они играют роль массива отверстий, фильтрующих возвращаемый образцом сигнал, с изменяемым диаметром и схемой расстановки.
Однако конфокальные микроскопы имеют и существенные недостатки. Так, возбуждение значительной части существующих флуорохромов осуществляется лазерным излучением ультрафиолетового или коротковолнового видимого диапазона, что разрушительно для живых клеток. Эта проблема была преодолена с введением в практику мультифотонных микроскопов, в которых в качестве подсветки используется излучение инфракрасного диапазона.
1.4. Мультифотонная микроскопия
Мультифотонная микроскопия вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10-13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.
Мультифотонная микроскопия вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10-13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.
Одним из вариантов мультифотонной микроскопии является микроскопия с использованием регистрации второй гармоники (Second-harmonic imaging microscopy SHIM). Метод генерации второй гармоники основан на нелинейном оптическом явлении, суть которого заключается в преобразовании средой двух фотонов с частотой w в один фотон с частотой 2w. Это означает, что помимо света на частоте лазера из среды выходит свет на удвоенной частоте вторая гармоника. Генерация второй гармоники обусловлена рассеянием света в среде и возможна при действии поляризованного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона. Подробное изложение физико-химических основ этого процесса приведено в учебнике под редакцией Б. И. Манцызова (2009). Отметим, что не все биологические образцы могут генерировать вторую гармонику. Классическим объектом для этого вида микроскопии является роговица глаза, которая преимущественно состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон источника генерации второй гармоники.
1.5. Конфокальная микроскопия в применении к исследованию динамических процессов и межмолекулярных взаимодействий
1.5.1. Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Recovery After Photobleachin FRAP)
Данная техника применяется для исследования подвижности биоорганических молекул, например для измерения коэффициента латеральной диффузии некоторого белка или для изучения полимеризации белков. Основной принцип метода заключается в том, что белок интереса метят флуоресцентной меткой, с помощью ослабленного аттенюаторами возбуждающего излучения регистрируют фоновую флуоресценцию; после этого на короткий промежуток времени (несколько миллисекунд) увеличивают интенсивность облучения, что приводит к выжиганию флуорохрома; затем снижают интенсивность до исходной и регистрируют флуоресценцию с отбеленного участка (Соболев А. С., 2000). Если молекулы с флуорохромом из соседней необлученной зоны (например, посредством диффузии) перемещаются в облученную область, то по времени нарастания флуоресценции можно судить об их подвижности. Несколько лет назад была разработана модификация этого метода обратный FRAP или iFRAP, который с успехом применяется для изучения подвижности молекул в малом объеме или кинетики диссоциации молекул. В этой модификации фотоотбеливанию подвергаются флуоресцентно меченые молекулы во всей клетке за исключением малого объема, затем регистрируется изменение уровня флуоресценции в этом объеме (Dailey M. E. [еt al.], 2006).
1.5.2. Потеря флуоресценции во время фотоотбеливания (Fluorescence Lossin Photobleaching FLIP)
Техника FLIP используется для выявления взаимодействий между молекулами из разных компартментов клетки или для изучения подвижности молекулы внутри компартмента. Например, для наблюдения передвижения определенного белка из цитоплазмы в ядро. Эксперименты в технике FLIP отличаются от FRAP и iFRAP тем, что выжигание флуоресценции в одной и той же области образца производится несколько раз с целью предотвращения восстановления флуоресценции в ней. При повторном отбеливании определенной области возникает потеря флуоресценции в пограничной области. По потере флуоресценции в области пограничной с облучаемой можно судить о передвижении фракции меченных флуоресцентным красителем белков и, наоборот, по остаточной флуоресценции можно определить долю неподвижных молекул. FLIP часто используется в комбинации с FRAP, чтобы получить обобщенную информацию об активном и пассивном перемещении меченых белков.