Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии
Коржевский Дмитрий Эдуардович доктор медицинских наук, заведующий лабораторией функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;
Кирик Ольга Викторовна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;
Петрова Елена Сергеевна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;
Карпенко Марина Николаевна кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории нейробиологии интегративных функций мозга физиологического отдела им. И. П. Павлова ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;
Григорьев Игорь Павлович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;
Сухорукова Елена Геннадьевна старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;
Колос Елена Андреевна младший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;
Гиляров Александр Владимирович кандидат медицинских наук
УСЛОВНЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
БТIII бета-тубулин III
ГАМК γ-аминомасляная кислота
ГЭБ гематоэнцефалический барьер
ДААК декарбоксилаза L-ароматических аминокислот
ИГХ иммуногистохимия
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
МТ микротрубочка
НСК нейральные стволовые клетки
ПФ промежуточный филамент
ЦНС центральная нервная система
ABC-метод avidin and biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular сomplex
AEC 3-амино-9-этилкарбазол
AIF-1 allograft inflammatory factor-1
AP щелочная фосфатаза
APAAP «щелочная фосфатаза антищелочная фосфатаза»
AS-MX нафтол АС-Микс фосфат
BSA бычий сывороточный альбумин
CAM молекула клеточной адгезии
CDK циклин-зависимая киназа
CN 4-хлор-1-нафтол
CNP 2,3-циклический нуклеотид 3-фосфодиэстеразы
DAB 3,3-диаминобензидина
DCX даблкортин
EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота
ENO1 ненейрональная енолаза (α)
ENO2 нейронспецифическая енолаза (γ)
ENO3 мышечная енолаза (β)
FITC флуоресцеина изотиоцианат
GAD глутаматдекарбоксилаза
GFAP глиальный фибриллярный кислый белок
HRP пероксидаза хрена
LAB авидин-биотиновая методика
LSAB стрептавидин-биотиновая методика
L-ДОФА L-3,4-диоксифенилаланин
MAG миелин-ассоциированный гликопротеин
МАР2 микротубулин-ассоциированный протеин 2
MBP основной белок миелина
MOBP основной белок олигодендроцитов, связанный с миелином
MOG миелиновый гликопротеин олигодендроцитов
MRF-1 microglia response factor
NCAM нейрональная молекула клеточной адгезии
NF-H высокомолекулярные белки нейрофиламентов
NF-L низкомолекулярные белки нейрофиламентов
NF-M среднемолекулярные белки нейрофиламентов
NSE нейронспецифическая енолаза
OSP олигодендроцит-специфический белок
PAP пероксидаза-антипероксидазный метод
PBS фосфатно-солевой буфер
PCNA ядерный антиген пролиферирующих клеток
PGP протеиновые генные продукты
PI пропидий иодид
PKA сАМР-зависимая протеинкиназа
PLP протеолипидный белок
PRD домен, богатый пролином
PSA полисиаловая кислота
TBS трис-солевой буфер
TRITC тетраметилродамин изотиоцианат
ПРЕДИСЛОВИЕ
В последние годы методы иммуногистохимии заняли одно из главных мест среди методов морфологической диагностики. Неудивительно, что научная и методическая литература, посвященная их применению, привлекает пристальное внимание научных работников и специалистов практического здравоохранения. С сожалением приходится констатировать, что в настоящее время подобная литература отсутствует на прилавках отечественных книжных магазинов. Из наиболее важных руководств, изданных на русском языке после 1990 г., в которых определенное место отведено вопросам применения методов иммуногистохимии, следует отметить «Микроскопическую технику» (под ред. Д. С. Саркисова и Ю. Л. Перова. М.: Медицина, 1996), «Молекулярную клиническую диагностику» (под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги. М.: Мир, 1999) и фундаментальный обзор иммуноцитохимических методов М. В. Угрюмова (Итоги науки и техники. Серия «Морфология человека и животных». Т. 15. М.: ВИНИТИ, 1991). Перечисленные книги давно стали библиографической редкостью. Кроме того, следует признать, что они не включают информацию о некоторых современных методических приемах, получивших широкое распространение в последние годы (например, о способах теплового демаскирования антигенов). Все вышеперечисленное и побудило авторов к написанию данного краткого руководства.
Отличительной особенностью данного руководства является сочетание необходимых сведений о теоретических основах методов иммуногистохимии с примерами их практического использования на основе оригинальных и усовершенствованных авторами протоколов обработки препаратов, помещенных в приложении. Поскольку в круг интересов авторов входит изучение органов нервной системы, книга дополнена теоретическими сведениями и практическими рекомендациями по использованию важнейших нейрональных и глиальных маркеров дифференциации, что, несомненно, будет полезным как для нейроморфологов, так и для нейрофизиологов.
Настоящее руководство отражает современный уровень развития иммуногистохимии как науки и аккумулирует многолетний опыт сотрудников лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, связанный с использованием методов иммуногистохимии.
ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ
Первое издание этой книги вышло не так давно, но уже появилась необходимость выпустить исправленное и дополненное второе издание. Наибольшие изменения претерпели пятая и шестая главы, где описываются методы демаскирования антигенов и изложены практические приемы, используемые при постановке иммуногистохимических реакций. В шестой главе появился и новый раздел «Организация работы иммуногистохимической лаборатории». Внесено существенное добавление в главу 10 раздел, посвященный важному нейрональному маркеру белку PGP 9.5. Протокол обработки препаратов для постановки реакции на белок PGP 9.5 добавлен в приложение 5. Обновлен состав авторского коллектива, принимавшего участие в работе над текстами, вошедшими в состав руководства.
Авторы надеются, что внесенные изменения и дополнения увеличили информативность второго издания руководства, которое адресовано работникам практического здравоохранения и научным сотрудникам, использующим методы иммуногистохимического исследования в своей повседневной деятельности.
Глава 1.
ИММУНОГИСТОХИМИЯ СОВРЕМЕННЫЙ МЕТОД МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
Термин «иммуногистохимия» образован из трех составляющих, указывающих на три медико-биологические дисциплины, иммунологию, гистологию и химию, которые послужили основой для этого нового научного направления. Иммуногистохимия (ИГХ), или иммуноцитохимия (ИЦХ), это область биологической и медицинской науки, теоретическое обоснование, разработка и практическое применение современных методов гистологического исследования и микроскопической диагностики, базирующихся на использовании реакции «антиген антитело» для селективного выявления белков (и других молекул, обладающих антигенными свойствами) в гистологических срезах и цитологических препаратах.
Понятия «иммуногистохимия» и «иммуноцитохимия», по существу, должны считаться синонимами. Однако на практике нередко под иммуногистохимическими подразумевают методы, используемые для определения искомых антигенов в тканевых срезах, тогда как реакции с антигенами, выявляемыми в цитологических препаратах, называют иммуноцитохимическими. Следует заметить, что принципиальных различий в теоретических основах и практическом применении этих методов нет. В дальнейшем в настоящей книге будет использоваться термин «иммуногистохимия» и только в тех случаях, когда это будет необходимо в соответствии с контекстом, «иммуноцитохимия».
Современные методы иммуногистохимии и иммуноцитохимии разработаны на основе достижений иммунологии и молекулярной биологии и совершенствуются в соответствии с потребностями патогистологической диагностики, сохраняя свое значение важного инструмента научных исследований. Первые методы окраски гистологического препарата основывались на избирательном связывании красителей с компонентами клетки. Особую область гистологической техники составили методы импрегнации биологических объектов солями металлов. До середины ХХ века при разработке новых методов окраски часто использовался эмпирический подход. Быстрое развитие биохимии позволило создать ряд селективных методов выявления различных внутриклеточных субстанций и компонентов межклеточного вещества. В связи с достаточно понятными механизмами взаимодействия участвующих при их постановке реакций химических веществ эти методики получили название «гистохимические реакции». Однако гистохимические методы, как правило, не позволяют точно определять конкретные вещества, не всегда обладают высокой чувствительностью и нередко требуют специальных методов обработки материала, усложняющих гистологическое исследование. Таким образом, несовершенство существующих методик окраски закономерно привело к созданию нового направления науки, которое получило название «иммуногистохимия». Первые иммуногистохимические методы не отличались высокой чувствительностью, но благодаря высокой специфичности сразу стали использоваться в диагностических целях.
Современные методы иммуногистохимии и иммуноцитохимии разработаны на основе достижений иммунологии и молекулярной биологии и совершенствуются в соответствии с потребностями патогистологической диагностики, сохраняя свое значение важного инструмента научных исследований. Первые методы окраски гистологического препарата основывались на избирательном связывании красителей с компонентами клетки. Особую область гистологической техники составили методы импрегнации биологических объектов солями металлов. До середины ХХ века при разработке новых методов окраски часто использовался эмпирический подход. Быстрое развитие биохимии позволило создать ряд селективных методов выявления различных внутриклеточных субстанций и компонентов межклеточного вещества. В связи с достаточно понятными механизмами взаимодействия участвующих при их постановке реакций химических веществ эти методики получили название «гистохимические реакции». Однако гистохимические методы, как правило, не позволяют точно определять конкретные вещества, не всегда обладают высокой чувствительностью и нередко требуют специальных методов обработки материала, усложняющих гистологическое исследование. Таким образом, несовершенство существующих методик окраски закономерно привело к созданию нового направления науки, которое получило название «иммуногистохимия». Первые иммуногистохимические методы не отличались высокой чувствительностью, но благодаря высокой специфичности сразу стали использоваться в диагностических целях.