В настоящее время основными задачами иммуногистохимии можно считать разработку и теоретическое обоснование новых методов молекулярного анализа внутриклеточных структур, изучение продуктов экспрессии генов, изучение пролиферации и гибели клеток, гистотипирование опухолей (часть молекулярной и клеточной диагностики) и методическое обеспечение иммуноморфологии области гистологии, в которой используются иммуногистохимические методы для изучения тканевой организации, развития тканей и клеточной дифференциации.
Основателем нового направления в науке и диагностике и автором первых методов иммуноцитохимии по праву считают американского врача-патолога и иммунолога Альберта Хьюитта Кунса (1912 1978). Под его руководством в 1941 г. были впервые получены меченные флюорохромом антитела, которые были успешно применены в диагностических целях на замороженных срезах (Coons A. H. [et al.], 1941; 1942; 1950). Визуализация результатов реакции производилась во флуоресцентном микроскопе. Однако сначала метод не получил широкого распространения из-за трудности получения антител, сложности их визуализации и низкой воспроизводимости результатов. В последующем методы визуализации комплекса «антиген антитело» совершенствовались, увеличивались их чувствительность и воспроизводимость. Параллельно с этим разрабатывались новые методы очистки первичных антител, которые повышали специфичность иммуногистохимических реакций. С появлением новой технологии получения моноклональных антител (Köhler G. [et al.], 1975) иммуногистохимические методы получили широкое распространение в патогистологической диагностике в онкологии, поскольку наряду с высокой специфичностью и хорошей воспроизводимостью они обладают большей доступностью для стандартизации, без которой не может существовать ни один диагностический тест.
В нашей стране в настоящее время иммуногистохимические методы достаточно широко используются при патогистологической диагностике онкологических заболеваний (Петров С. В. [и др.], 2004). Морфологические диагностические подходы, основанные на использовании методов иммуногистохимии постепенно внедряются и в судебно-медицинской экспертизе (Коржевская В. Ф. [и др.], 2011).
Литература
Коржевская В. Ф., Сухорукова Е. Г., Кирик О. В. [и др.]. Особенности судебно-гистологического исследования головного мозга при смерти от тупой травмы головы. СПб.: Изд-во СПбМАПО, 2011. 35 с.
Петров С. В., Райхлин Н. Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань, 2004. 456 с.
Coons A. H., Creech H. J., Jones R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1941. Vol. 47. P. 200202.
Coons A. H., Creech H. J., Jones R. N. [et al.]. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by use of fluorescent antibody // J. Immunol. 1942. Vol. 45. P. 159170.
Coons A. H., Kaplan M. H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Biol. Med. 1950. Vol. 91, 1. P. 113.
Coons A. H., Creech H. J., Jones R. N. [et al.]. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by use of fluorescent antibody // J. Immunol. 1942. Vol. 45. P. 159170.
Coons A. H., Kaplan M. H. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. Biol. Med. 1950. Vol. 91, 1. P. 113.
Köhler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells producing antibody of pre-defined specificity // Nature. 1975. Vol. 256, 5517. P. 495497.
Глава 2.
ПЕРВИЧНЫЕ АНТИТЕЛА
2.1. Антитела компоненты сыворотки крови
Антитела это растворимые гликопротеины глобулиновой фракции сыворотки крови и других биологических жидкостей, образующиеся в ответ на введение или проникновение антигена (чужеродных веществ, в том числе бактерий, вирусов, токсинов) в организм теплокровных животных (Ройт А. [и др.], 2000). На сегодняшний день антитела являются наиболее важными реагентами для использования в фундаментальных и прикладных исследованиях, что обусловлено их способностью к высокоспецифическому связыванию с антигеном, вызвавшим их образование.
Применяя определенные методические приемы, можно добиться образования антител к практически неограниченному набору антигенов. Однако стоит отметить, что стоимость коммерческих антител и затраты на их получение в условиях лаборатории могут различаться в десятки раз в зависимости от требуемой чистоты, специфичности и области применения, поэтому еще на этапе планирования исследования стоит уделить особое внимание правильному подбору антител. В этом может помочь и данное руководство.
2.2. Строение антител
Классические антитела представляют собой крупные мультимерные белки. Основная четырехцепочечная структурная единица иммуноглобулинов образована полипептидными цепями двух разных типов. Меньшие по размеру цепи (легкие L-цепи) имеют молекулярную массу около 25 кДа и состоят из вариабельного VL- и константного СL-доменов. Более крупные (тяжелые H-цепи) имеют молекулярную массу 50 80 кДа, состоят из вариабельного VH-, трех константных СН1-, СН2-, СН3-доменов и шарнирного участка (hinge region). Полипептидные цепи удерживаются вместе ковалентными (дисульфидными) и нековалентными связями (Ройт А. [и др.], 2000). Схематически «типичная» структура антитела представлена на рис. 1.
Рис. 1. Структура кроличьего иммуноглобулина IgG. Тяжелые и легкие цепи образуют вариабельный и константный домены, которые соединены дисульфидными мостиками (). При помощи папаина (цистеиновой эндопротеазы) протеолиз разделяет молекулу, в результате чего образуются два антигенсвязывающих фрагмента (Fab) и один кристаллизующийся фрагмент (Fc). Под действием пепсина (аспартатной кислой эндопептидазы) происходит отщепление двухвалентного антигенсвязывающего фрагмента (Fab)2 (по: Boenisch T., 2001; с изменениями)
В зависимости от размера, заряда, аминокислотной последовательности и содержания углеводов в составе тяжелой цепи различают пять изотипов (классов) антител: IgM, IgG, IgA, IgE и IgD. Класс IgG подразделяется на четыре подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), которые различаются по антигенной структуре и спектру биологических функций (Burton D. R. [et al.], 1996). IgG это наиболее широко представленный класс иммуноглобулинов, на его долю приходится 70 75 % их общего количества. Класс IgA разделяют на два подкласса (IgA1, IgA2). Все классы и подклассы составляют девять изотипов, которые присутствуют в норме у всех теплокровных. Кроме того, IgM является пентамером, т. е. пять молекул соединяются между собой, а IgA димером.
При помощи папаина антитела можно расщепить на два одинаковых антигенсвязывающих Fab-фрагмента (fragment antigen binding) и Fc-фрагмент (fragment cristalizable), способный к кристаллизации. Область Fab образована гипервариабельными участками Ни L-цепей и определяет антигенную специфичность; Fc-фрагмент осуществляет эффекторные функции (связывание иммуноглобулина с клетками, компонентами комплемента) (Atassi M. Z., 1984). К Fc-фрагменту антител можно присоединять различные вещества, что используется при постановке иммунохимических реакций.
В 1993 г. группой бельгийских ученых было сделано важное открытие: кроме классических антител в крови некоторых животных (верблюдов, лам и др.) обнаруживаются особые, неканонические антитела с упрощенной структурой. Они состоят из димера укороченной (без CH1-домена) тяжелой цепи; легкая цепь отсутствует, т. е. антигенузнающий участок формируется лишь вариабельными доменами тяжелых цепей. Такие антитела принято называть однодоменными антителами, или мини-антителами. Благодаря малым размерам (молекулярная масса однодоменных антител составляет примерно 12 15 кДа) и компактности антигенсвязывающего участка, можно получить мини-антитела, способные узнавать участки антигенов, недоступные для классических антител, в этом состоят весомые преимущества мини-антител (Тиллиб С. В., 2011).
2.3. Особенности связывания антитела с антигеном
В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген антитело». Антигенами обычно являются высокомолекулярные белки и полисахариды, реже полипептиды, липиды и нуклеиновые кислоты. Иммунный ответ могут вызывать и небольшие молекулы, или гаптены, в том случае если они соединяются с высокомолекулярными носителями (белками, полисахаридами). В качестве гаптенов могут выступать лекарственные вещества, моно- и полисахариды, небольшие полипептиды, фосфолипиды, триглицериды, моноамины.
Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом. Обычно в эпитоп входит от одной до шести молекул моносахаридов или аминокислот, расположенных на поверхности антигена. Антитела распознают не отдельные химические группы в структуре антигена, а пространственную форму эпитопов. Они способны улавливать различия в распределении зарядов на поверхности антигена, оптическую и стереоизомерию, минимальные различия в первичной структуре. Вследствие этого б|ольшая часть антител способна связываться только с нативными антигенами или с фрагментами антигена, сохраняющими третичную структуру. Следовательно, для успешного взаимодействия антигена и антитела эпитоп должен находиться на поверхности молекулы. Следует учитывать, что при денатурации молекул (например, под действием фиксирующих жидкостей, экстремальных значений pH буферных растворов и др.) эпитоп может повышать или понижать свою иммуногенность.
Большие молекулы (например, белки) имеют несколько эпитопов, поэтому они стимулируют образование антител нескольких видов к разным эпитопам одного и того же антигена. Такие антитела называют поликлональными. Они более толерантны к незначительным конформационным изменениям антигена (полиморфизму, различной степени гликозилирования, фосфорилирования, частичной денатурации), что дает больше возможностей экспериментатору при планировании исследований.
Антитела, реагирующие с одним единственным эпитопом, называют моноклональными. В отличие от поликлональных антител, они чувствительны даже к небольшим конформационным изменениям антигена. Например, можно получить моноклональные антитела, узнающие молекулу белка, фосфорилированную по определенному сайту. Благодаря высокой специфичности моноклональные антитела являются отличными первичными антителами, то есть антителами для выявления искомого антигена, так как они дают слабое неспецифическое связывание, а значит, и меньшее фоновое окрашивание. По сравнению с поликлональными антителами они обладают большей гомогенностью, что обеспечивает высокую воспроизводимость результатов. Однако связывание с единственным эпитопом обусловливает низкую чувствительность, проявляющуюся в слабом иммуноокрашивании на срезах. К тому же высока вероятность того, что фиксатор сделает этот единственный эпитоп недоступным для антител, в результате чего иммуноокрашивания вообще не произойдет. Кроме того, методы получения моноклональных антител более сложные и трудоемкие, чем методы получения поликлональных иммунных сывороток, что приводит к значительному увеличению их стоимости.