Окрашивание срезов. Срезы окрашивают, чтобы увеличить контрастность различных гистологических структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. Разработаны разнообразные методы окраски. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство структур клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.
Все красители подразделяют на кислые, основные и специальные. Структуры срезов, хорошо окрашивающиеся кислыми красителями, называют оксифильными, основными красителями базофильными окрашивающиеся как теми, так и другими нейтрофильными. Специальные красители селективно выявляют конкретные структуры, обладающие сродством к ним. Наиболее широко распространен комбинированный метод окраски тканей гематоксилином и эозином. Гематоксилин (основной краситель) окрашивает ядра клеток в синефиолетовый цвет, а эозин (кислый) элементы цитоплазмы в розово-желтый. Окрашенные препараты обезвоживают в спиртах восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %), просветляют в ксилоле или некоторых маслах и затем каждый гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или синтетические смолы. Готовый (постоянный) гистологический препарат можно хранить годами и использовать для микроскопирования.
Методы микроскопии. Основным инструментом для изучения гистологического препарата служит микроскоп световой или электронный.
Световая микроскопия. С помощыо современных световых микроскопов (МБР-1 микроскоп биологический рабочий, МБИ-1, МБИ-3 или МББИ микроскоп бинокулярный биологический исследовательский, ЛЮМАМ и других) можно изучать на срезах строение клеток и тканей. Размер наименьшей структуры, которую можно увидеть в световом микроскопе, определяется наименьшим разрешающим расстоянием (d0). У современных микроскопов оно составляет около 0,2 мкм. Приближенно разрешение, или разрешающую способность, можно рассчитать по формуле:
λгде λ длина световой волны.
Для более точного расчета используют формулу, учитывающую конструкцию объектива:
Для более точного расчета используют формулу, учитывающую конструкцию объектива:
где n показатель преломления среды между препаратом и фронтальной линзой объектива;
sin α синус угла между оптической осью и наиболее сильно отклоняющимся лучом, который еще попадает в линзу объектива.
В микроскопических исследованиях используют следующие единицы измерения:
1мкм (микрометр)=1×10-3 мм = 1×10-6 м;
1 нм (нанометр) = 1×10-3 мкм = 1×10-6 мм = = 1×10-9 м;
1 Å (ангстрем) = 0,1 нм = 1×10-4 мкм = 1×10-7 мм = 1×10-10 м.
Из приведенных данных видно, что разрешающая способность световых микроскопов ограничена десятыми долями микрона (микрометра). Структуры клетки меньшего размера можно рассмотреть только с помощью электронного микроскопа. Подробное описание светового и электронного микроскопов дано в соответствующих руководствах и в курсе физики.
Ультрафиолетовая микроскопия представляет собой разновидность световой. Длина волны ультрафиолетовых лучей составляет около 0,3 мкм; разрешающая способность микроскопа при иммерсионном объективе приблизительно 0,1 мкм.
Люминесцентная микроскопия основана на том, что многие органические вещества, содержащиеся в клетках, способны светиться (флуоресцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции постоянно смещен в сторону более длинных волн по отношению к изучению, возбуждающему флуоресценцию. Этот спектр лежит в пределах коротких волн (длина от 0,25 до 0,4 мкм). Например, хлорофилл зеленых растений в ультрафиолетовых лучах светится красным светом, а другие вещества зеленым или желтым (то есть с более короткими волнами). Этот принцип использован при создании люминесцентных микроскопов. Источником света в них служат ксеноновые или ртутные лампы (их спектр близок к ультрафиолетовому излучению), а объект исследуют через специальные фильтры.
Собственной, или первичной, флуоресценцией обладают пигменты (в том числе бактерий), витамины А и В2, индоламины и некоторые другие вещества. Существует вторичная, или вызванная, флуоресценция. Чтобы ее получить, используют специальные вещества флуорохромы, которые связываются различными структурами живой клетки и вызывают их флуоресценцию. Например, при обработке срезов тканей флуорохромом акридиновым оранжевым дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и ее производные приобретают яркозеленое свечение, а рибонуклеиновая кислота (РНК) и ее производные яркокрасное. Разновидностью вторичной является флюоресценция желто-зеленого цвета, индуцированная парами формальдегида и характерная для катехоламинов (адреналин и норадреналин) мозгового вещества надпочечников. Таким образом, можно исследовать химический состав тканевых структур, выявлять трофические и секреторные включения в клетках.
Электронная микроскопия. В электронном микроскопе используются электронные лучи с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн при напряжениях от 50000 до 100000 В. Длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока или пучка электронов в условиях вакуума равна 0,0056 нм. Таким образом, разрешение достигает 0,002 нм или 0,000002 мкм, что в 100000 раз выше, чем в световом микроскопе. Разрешающая способность современных отечественных электронных микроскопов (ЭМВ-200, 300) и зарубежных (фирм Хитачи, Филипс) составляет не более от 1 до 5 А, однако на практике она не превышает от 0,2 до 0,5 нм, а для большинства биологических объектов от 1 до 2 нм. Методом электронной микроскопии исследуют ультратонкие срезы, толщиной от 500 до 1000 А, которые готовят на ультратомах сложных электронных приборах, где ножами служат очень острые грани сломов зеркального стекла. Тончайшие срезы наносят на специальные металлические сетки с ячейками и помещают в вакуумную камеру электронного микроскопа. Обработка образцов тканей для ЭМ сходна с ранее описанной обработкой для световой микроскопии. Только здесь в качестве фиксаторов используют забуференные растворы параформа, тетроксида осмия, глютаральдегида (рН 7,0 7,4); образцы проводят через спирты восходящей концентрации и пропилен-оксид и заливают в синтетические смолы (аралдит, эпон или в их смесь). Чтобы более четко выявить, органеллы мембранного и немембранного типа в качестве контрастера применяют цитрат свинца и уранилацетат.
К современным электронно-микроскопическим методам относят просвечивающую, или трансмиссионную электронную микроскопию (ПЭМ), сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) электронную авторадиографию, иммунно-электронную микроскопию, ЭМ-гистохимию.
СЭМ от ПЭМ отличается тем, что в первом электроны не проходят сквозь объект, а отражаются от его поверхности, сканируя ее. Сфокусированный пучок электронов, формируемый электронно-магнитными линзами, следует через отклоняющую катушку, которая перемещает его по поверхности препарата, покрытого тонким слоем металла (золотое или платиновое напыление). С поверхности препарата пучком выбиваются вторичные электроны, которые регистрируются и преобразуются в трехмерное изображение на экране. В отличие от ПЭМ для СЭМ можно использовать коррозийные препараты: объект изучения, например микроциркуляторное русло лимфатических сосудов, заливают какимилибо затвердевающими веществами и после этого просматривают слепки и его поверхности. Изучают также реплики, получаемые путем замораживания скалывания. В этом случае исследуют слепок скола поверхности объекта. Чтобы увеличить контрастность, реплики необходимо оттенить с помощыо напыления частиц металлов (золота, платины) или угля.
Методы качественного и количественного анализа гистологических структур. Качественные гистохимические методы основаны на использовании реакций, с помощыо которых выявляют различные химические вещества в клетках тканей и органов. Зная, как распределяются в тканях белки, жиры, углеводы, ферменты и другие вещества в норме и при различных воздействиях на организм, можно судить с большей или меньшей вероятностью направленности метаболических процессов в исследуемых структурах. Современными гистохимическими методами обнаруживают в клетках аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, определяют активность различных ферментов, например в цикле Кребса. Выявление этих веществ основано на специфичности реакций между химическим реактивом и субстратом, входящим в состав клеточных и тканевых структур, и на выделении продуктов химических реакций в виде окрашенных осадков. Чтобы повысить специфичность реакций, часто применяют метод ферментативного контроля. Например, для выявления ДНК и РНК используют галлоцианин хромовые квасцы, окрашивающие нуклеиновые кислоты в стойкий сине-фиолетовый цвет. ДНК обнаруживают с помощыо реакции Фёльгена. Срезы подвергают кислотному гидролизу (1 н НСl при 60 °C), при этом освобождаются альдегидные группировки дезоксипентозы в ДНК. Затем срезы переносят в фуксинсернистую кислоту, которая взаимодействует только с альдегидными группировками хроматина, обусловливая его пурпурную окраску. Срезы, предварительно обработанные дезоксирибонуклеазой ферментом, расщепляющим ДНК не окрашиваются, что подтверждает наличие в структуре ДНК.
Методами иммуноцитохимии можно идентифицировать клетки различных типов и их рецепторы по маркерным признакам, изучать синтетические и секреторные процессы. Методы основаны на обработке срезов (или мазков) специфическими антителами к выявляемому веществу, которое служит антигеном. Антитела маркируют путем конъюгации с флуоресцентными красителями, ферментами, которые затем выявляются цитохимически или электронно-плотными частицами (ферритин).
С помощью количественных гистохимических методов изучают химический состав конкретных структур клетки.
Цитоспектрофотометрия это метод количественного и качественного изучения веществ по спектру их поглощения в структурах отдельной клетки. С его помощью можно установить суммарное содержание белков или других элементов. В основе метода лежит принцип абсорбционной спектрофотометрии. Например, с помощыо интерферометрии можно оценить сухую массу и концентрацию плотных веществ в живой и фиксированной клетке.
Метод дифференциального центрифугирования основан на применении центрифуг, развивающих скорости от 20000 до 150000 мин и более. При центрифугировании в определенных условиях, например, в сахарозе в зависимости от градиента плотности, удается отделить и осадить различные органеллы клеток: ядра, митохондрии, фракции пиноцитозных и синаптических пузырьков, рибосом и других компонентов, пригодных для гистохимического исследования.
Метод авторадиографии широко применяют для изучения кинетики клеточных популяций, метаболических процессов в клетках, и определения участков синтеза биополимеров с помощью регистрации веществ, меченых изотопами. Для этого в ткань животного или в среду с культивируемыми клетками вводят предшественников какого-либо макромолекулярного соединения (например, аминокислоты, нуклеотиды), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом (например, радиоактивного водорода Н углерода С14, серы, фосфора и других). В процессе синтеза белков, гормонов, ферментов или иных веществ в них включается молекула меченого предшественника. Для регистрации места ее включения в темноте на окрашенные обычными методами срезы наносят специальную мелкозернистую фотоэмульсию, после чего срезы проявляют. На участках соприкосновения фотоэмульсии с радиоактивным веществом происходит фотореакция, в результате которой образуются засвеченные участки метки, или треки. Этим методом можно, например, определить время перемещения клеток, меченых Н3-тимидином в пластах многослойного эпителия, скорость включения меченых аминокислот в белки, синтез йодсодержащих гормонов в щитовидной железе. С помощыо меченого лейцина, радиоактивных предшественников адреналина, норадреналина к серотонина можно определить не только скорость аксонального транспорта от нейронов к клеткам-мишеням, но и установить топографию нервных связей.