Методы исследования живых клеток и тканей. Современная гистология располагает многочисленными и разнообразными методами, с помощыо которых можно всесторонне изучать строение и функцию живых клеток, тканей органов.
Фазовоконтрастная микроскопия. Естественные биологические объекты в силу наличия в них жидкостей, прозрачны, бесцветны и неконтрастны, Их структуры по отношению к проходящему свету характеризуются одинаковой поглощающей способностью. В отличие от обычной световой микроскопии, где клеточные структуры контрастируют с помощыо окрашивания препарата, в фазовоконтрастном микроскопе системы Намарского, контрастирование достигается благодаря использованию специального объектива и конденсора. Последний преобразует фазовые изменения проходящего через объект света в изменение освещенности полученного изображения. Световые волны могут интерферировать, увеличивая или уменьшая амплитуду результирующих волн. Таким образом, разные компоненты клеток становятся различимыми под микроскопом. В фазовоконтрастном микроскопе различия в амплитуде достигаются благодаря использованию двух пучков световых волк; один падает на объект, другой дифрагируют от него. Данный метод используют, в частности, для прижизненного изучения пленочных препаратов, а также культур клеток и тканей.
Для специальных целей применяют темнопольную и поляризационную микроскопию, в основе которых также лежат особенности интерференции световых волн и возможность преобразования фазовых различий, незаметных для человеческого глаза, в амплитудные.
Методы культивирования и трансплантации клеток и тканей. Сложность изучения тканей в организме обусловлена гетерогенностью и полифункциональностью их клеточного состава, наличием различных барьеров (гематотканевого, гематонервного и других), разнообразием межклеточных и межтканевых взаимоотношений. Изолированные клетки или ткани (культуры) оказываются свободными от воздействия окружающих тканей, от нервных, гуморальных и других влияний, таким образом, становится возможным изучать рост, дифференцировку и взаимоотношения клеток в так называемом «чистом виде».
Изучать культуры тканей можно как вне организма (in vitro), так и в составе организма (in vivo). При культивировании in vitro клетки и фрагменты тканей помещают в специальные флаконы, пробирки, чашки Петри или камеры Максимова. Для культивирования используют как эмбриональные, так и взрослые, обновляющиеся ткани: элементы соединительной ткани (фибробласты), хрящевую и мышечную ткани (поперечно полосатые мышечные волокна и гладкие миоциты), клетки эпителиальных тканей (печени, легких, различных желез), нейроциты, нейроглию и другие.
Клетки и ткани нуждаются в определенных условиях для пролиферации, роста и дифференцировки. Подходящим субстратом для прикрепления, или адгезии, клеток могут служить различные искусственные поверхности или покрытия: фибронектин, полилизин, ламинин, особенно часто употребляют коллаген. Подложки наносят на покровные стекла или на дно пластмассовых чашек в качестве субстрата, необходимого для поддержания длительной жизнедеятельности клеточных и тканевых структур. Не менее важную функцию выполняют питательные среды, которые должны обеспечивать клетки питанием, гормональными факторами, а также элементами межклеточного матрикса. Чаще всего в качестве питательных сред используют гидролизат лактальбумина (ГЛА), гидролизат мышечных белков (ГМБ), среду Игла (МЕМ), 199-ю среду, сыворотку крови крупного рогатого скота, телячью сыворотку, мозговой эмбриональный экстракт и другие.
В зависимости от поставленных задач можно получить культуры органотипические или тканевые; диссоциированные; реагрегированные; линейные перевиваемые.
При культивировании кусочков тканей или органов in vivo их помещают в специальные небольшие камеры из миллипоровых фильтров и подсаживают в различные участки тела животного (под кожу, в переднюю камеру глаза). Особенность этого метода заключается в том, что жизнедеятельность клеток протекает в условиях целостного организма, с которым они сохраняют связь, и обмен веществ осуществляется через стенку миллипорового фильтра.
Кроме перечисленных методов, достаточно интенсивное развитие получили аутотрансплантация и гетеротрансплантация тканей. Положительные успехи достигнуты в области пересадки клеток островков Лангерганса, синтезирующих инсулин, в поджелудочную железу, а также в области нейротрансплантации пересадки нейроэндокринных клеток и эмбриональных нейронов из различных структур центральной и периферической нервной системы в аналогичные отделы поврежденного головного мозга (в неокортеке, ядра шва, черную субстанцию), чтобы возместить дефицит нейрогормонов или нейромедиаторов при некоторых неврологических заболеваниях человека. В качестве экспериментальных объектов пока используют животных.
В зависимости от поставленных задач можно получить культуры органотипические или тканевые; диссоциированные; реагрегированные; линейные перевиваемые.
При культивировании кусочков тканей или органов in vivo их помещают в специальные небольшие камеры из миллипоровых фильтров и подсаживают в различные участки тела животного (под кожу, в переднюю камеру глаза). Особенность этого метода заключается в том, что жизнедеятельность клеток протекает в условиях целостного организма, с которым они сохраняют связь, и обмен веществ осуществляется через стенку миллипорового фильтра.
Кроме перечисленных методов, достаточно интенсивное развитие получили аутотрансплантация и гетеротрансплантация тканей. Положительные успехи достигнуты в области пересадки клеток островков Лангерганса, синтезирующих инсулин, в поджелудочную железу, а также в области нейротрансплантации пересадки нейроэндокринных клеток и эмбриональных нейронов из различных структур центральной и периферической нервной системы в аналогичные отделы поврежденного головного мозга (в неокортеке, ядра шва, черную субстанцию), чтобы возместить дефицит нейрогормонов или нейромедиаторов при некоторых неврологических заболеваниях человека. В качестве экспериментальных объектов пока используют животных.
3 Цитология
3.1 Общий план строения клетки
Между клеткой и окружающей ее средой существует хорошо очерченная граница. Эта граница плазматическая мембрана клетки. Плазматическая мембрана определяет величину клетки, обеспечивает сохранение существующих различий между клеточным содержимым и окружающей средой. Она отвечает за транспорт веществ в клетку и из нее, являясь высокоизбирательным фильтром. Кроме того, воспринимает внешние сигналы и участвует в адгезии, слипании клеток.
Плазматическая мембрана растений кнаружи от себя формирует клеточную оболочку, или стенку, которая представляет, в сущности, наружный остов клетки. Разнообразные функции, которые выполняют плазматическая мембрана и ее вторичные образования, возникающие в результате усложнения структуры, очень важны.
Внутренние клеточные структуры содержат два основных компонента цитоплазму с включенными в нее органеллами, или органоидами, и клеточное ядро. Цитоплазма эукариотических клеток весьма неоднородна по своему строению. Она содержит систему внутренних мембран, из которых формируются клеточные органеллы. Мембраны образуют лабиринт эндоплазматической сети, или эндоплазматического ретикулума, где синтезируются основные вещества клетки, аппарат Гольджи, лизосомы и пероксисомы, митохондрии и пластиды. Лишь небольшая часть клеточных органелл является немембранной: клеточный центр, рибосомы, микротрубочки и микрофиламенты. Цитоплазму, лишенную всех органелл, называют гиалоплазмой или цитозолем (рисунок 3.1).
1 клеточная мембрана; 2 вакуоль; 3 ядерная мембрана: 4 ядрышко; 5 хромосома; 6 ядро; 7 митохондрия; 8 лизосома; 9 центриоли; 10 эндоплазматический ретикулум; 11 аппарат Гольджи; 12 свободные рибосомы.
Рисунок 3.1 Общий план строения клетки животных организмов
Сложно организованы ядра эукариотических клеток. Они имеют двуслойную оболочку кариотеку, образованную мембранами, которая отделяет ядро от цитоплазмы; ядерный сок или кариоплазму, содержащую хроматин и ядрышко.
Клеточные структуры в соответствии с их функциями можно разделить на три типа:
1) поверхностный аппарат клетки, включающий плазматическую мембрану и ее производные;
2) метаболический аппарат (цитоплазма и ее органоиды);
3) наследственный или ядерный аппарат клетки.
3.2 Поверхностный аппарат клетки
Поверхностный аппарат клетки имеет сложное строение. В основе его лежит плазматическая мембрана, с которой снаружи связан надмембранный комплекс гликокаликс, а изнутри опорно-сократительный аппарат гиалоплазмы. Плазмолемма (plasmolemma), или внешняя клеточная мембрана, самая толстая из цитомембран: её толщина 10 нм. Плазмолемма состоит из билипидного слоя, встроенных в него белковых молекул и гликокаликса (рисунок 3.2).
А строение; Б участие в рецепции: I надмембранный слой (гликокаликс); II липопротеиновая мембрана; 1 6 белки.
Рисунок 3.2 Плазмалемма
Лежащий в основе плазмолеммы билипидный слой образуют полярные молекулы фосфолипидов (с гидрофильной головкой и гидрофобными хвостиками), а также молекулы холестерина. Билипидный слой асимметричен, почти все гликолипиды сконцентрированы в наружном монослое, в котором, кроме того, сосредоточены высокомолекулярные, более насыщенные жирные кислоты, в отличие от внутреннего слоя, в состав которого входят ненасыщенные жирные кислоты. Внутренняя сторона мембраны по отношению к наружной заряжена более отрицательно. В билипидном слое находятся различные белки: интегральные, полуинтегральные и субповерхностные. Белки обеспечивают такие функции клетки как рецепцию, регулируемый транспорт, структурную организацию процессов метаболизма и др. Интегральные белковые молекулы, прочно ассоциированные липидами, нельзя выделить из мембран, не разрушив последних, в отличие от легкоэстрагируемых периферических белков, расположенных вне билипидного слоя, но либо ковалентно связанных непосредственно с липидами, либо через олигосахарид с фосфатидилинозитолом наружного монослоя. Интегральные белки могут быть соединены с многочисленными углеводными остатками и, по существу являться гликопротеинами. От консистенции билипидного слоя во многом зависит активность мембраны.
А строение; Б участие в рецепции: I надмембранный слой (гликокаликс); II липопротеиновая мембрана; 1 6 белки.
Рисунок 3.2 Плазмалемма
Лежащий в основе плазмолеммы билипидный слой образуют полярные молекулы фосфолипидов (с гидрофильной головкой и гидрофобными хвостиками), а также молекулы холестерина. Билипидный слой асимметричен, почти все гликолипиды сконцентрированы в наружном монослое, в котором, кроме того, сосредоточены высокомолекулярные, более насыщенные жирные кислоты, в отличие от внутреннего слоя, в состав которого входят ненасыщенные жирные кислоты. Внутренняя сторона мембраны по отношению к наружной заряжена более отрицательно. В билипидном слое находятся различные белки: интегральные, полуинтегральные и субповерхностные. Белки обеспечивают такие функции клетки как рецепцию, регулируемый транспорт, структурную организацию процессов метаболизма и др. Интегральные белковые молекулы, прочно ассоциированные липидами, нельзя выделить из мембран, не разрушив последних, в отличие от легкоэстрагируемых периферических белков, расположенных вне билипидного слоя, но либо ковалентно связанных непосредственно с липидами, либо через олигосахарид с фосфатидилинозитолом наружного монослоя. Интегральные белки могут быть соединены с многочисленными углеводными остатками и, по существу являться гликопротеинами. От консистенции билипидного слоя во многом зависит активность мембраны.