Цервицит - Трусов Юрий Викторович 2 стр.



Таблица 1

Диагностический диапазон титров антител IgG, IgA, IgM при хламидиозе


Стадия заболевания

Дипазон титров IgG

Диапазон титров IgA

Диапазон титров Ig M


Первичная/острая


Определяются Ig M

>100−6400

> 50−1600

> 50−3200


Хроническая


Определяются Ig А

>100−1600

>50−200

<50


Реактивация/Реинфекция


Определяются Ig G, IgA

>100−51200

>50−400

<50


Состояние после Реконвалесценции


Определяется IgG

>100−400

<50

<50


Молекулярно – биологические методы – методы на основе амплификации (лат. amplificatio – усиление, увеличение), нуклеиновых кислот: процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК сигнала, мишени и зонда.

При использовании методов амплификации сигнала, в ходе реакции увеличения концентрации мишени или зонда не происходит. Значительное повышение аналитической чувствительности метода достигается за счет связывания с мишенью множества меченых молекул. Один из вариантов этого подхода (hybrid capture assay – метод захвата гибридных молекул) используется в коммерческих тест-системах для выявления C. trachomatis. Метод основан на гибридизации в растворе ДНК-мишени и РНК-зонда. Образовавшиеся гибридные молекулы захватываются иммобилизованными антигибридными антителами. Затем к иммобилизованным гибридным молекулам присоединяются антигибридные антитела, меченные щелочной фосфатазой. Реакция оценивается по интенсивности люминесценции, ее высокая чувствительность определяется тем, что к одной гибридной молекуле (ДНК+РНК) присоединяется множество молекул меченых антител.

Амплификация зонда. При использовании этих методов продукт амплификации представлен только нуклеотидными последовательностями, входящими в состав зонда. Наиболее известным вариантом этого метода является лигазная цепная реакция.

Амплификация мишени. Все методы, относящиеся к этой группе, основаны на проведении энзиматических реакций, в процессе которых один или несколько ферментов синтезируют множественные копии нуклеиновой кислоты – мишени.

Классическая ПЦР. Амплификация ДНК-мишени осуществляется в ходе повторяющихся циклов, каждый из которых включает денатурацию ДНК-мишени при температуре более 900С, отжиг на каждой одноцепочечной молекуле ДНК комплементарного праймера (олигонуклеотида) при понижении температуры до 550С – 650С, достройку двухцепочечной молекулы ДНК с каждого праймера в результате энзиматической активности термостабильной ДНК-полимеразы. По окончании цикла происходит удвоение фрагментов ДНК-мишени. Для детекции продуктов амплификации используются электрофоретический и гибридизационно-флуоресцентный методы.

ПЦР в реальном времени позволяет предотвратить перекрестную контаминацию исследуемых образцов, которая свойственна классической ПЦР, благодаря её высокой чувствительности. Для детекции продуктов амплификации разработаны технологии, основанные на комплексе ферментативных реакций, в результате которых в реакционной смеси возникает флюоресцентный сигнал, по интенсивности пропорциональный количеству образовавшегося продукта амплификации. ПЦР в реальном времени может быть использована для определения количественного содержания ДНК-мишени в биологическом образце.

Методы амплификации, основанные на транскрипции, реализуются при постоянной температуре, а мишенью является РНК хламидий. На начальных этапах реакции при участии обратной транскриптазы на матрице РНК – мишени происходит синтез комплементарной ДНК. Затем с помощью РНК полимеразы синтезируются множественные копии РНК. В настоящее время распространены амплификация, основанная на транскрипции (TMA – Transcription Mediated Amplification) и амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA – Nucleic Acid Sequence Based Amplification), различающиеся происхождением используемых в реакциях ферментов и методами детекции продуктов амплификации.

Метод амплификации со смещением цепочки относится к изотермическим, концептуально сложен, но технически прост в исполнении и наиболее часто используется для детекции не только хламидий, но и гонококков. Следует заметить, что в Скандинавии появились варианты C. trachomatis, у которых в результате мутации отмечено отсутствие участка криптической плазмиды C. trachomatis, являющейся мишенью для данного метода.

Таким образом, для постановки диагноза урогенитальной хламидийной инфекции рекомендуeтся использовать валидные и разрешенные к применению методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) и не рекомендуются использование культурального метода и методов основанных на выявлении антигенов хламидий или антител к ним, экспресс-тесты у постели больного. Наиболее информативным может быть клинический материал, если он получен при наличии клинических признаков заболевания, отсутствии использования лекарственных препаратов местно минимум в течение последних 48 – 72 часов, в середине менструального цикла в дни, когда нет кровянистых выделений.

Если, например, при ПЦР в реальном времени обнаруживается 469 копий / мл и выше, то концентрация хламидий считается диагностически значимой и назначается этиотропная и иммунокорригирующая терапия. В противном случае (при концентрации хламидий 100 – 498 копий / мл ) результат исследования признаётся сомнительным и требуется применение культурального метода. В последнем случае окончательно решается: есть инфицирование хламидиями или нет. При этом скрининговые методы (ИФА, ПИФ) могут выступать при положительной детекции хламидий своеобразными «поставщиками» клинических образцов для дальнейшего исследования МАНК. Последние решают проблему низкой чувствительности культурального метода, но не могут его заменить при определении чувствительности хламидий к антибиотикам.

Получение клинического образца. Оптимальным для присутствия и размножения хламидий являются определенные участки цилиндрического эпителия: слизистая оболочка цервикального канала на глубине 1,5 см. При взятии материала из этой зоны ключевым моментом является удаление слизистой пробки. От тщательности проведения этой подготовительной процедуры во многом зависит правильность соскоба клеток цервикального канала. Слизистую пробку удаляют ватным тампоном и пинцетом, а затем берут материал специальной щеточкой cervix brush / voba-brush или ложечкой Фолькмана. Для получения репрезентативного результата важно присутствие в образце клеток со всей поверхности цервикального канала и зоны трансформации. Щеточка вводится в канал на 1−2 см и вращается 15 секунд .

Забор материала у девочек производится со слизистой оболочки преддверия влагалища, в отдельных случаях – из заднего свода влагалища через гименальное кольцо.

Наличие в образцах выделений и примесей крови маскирует хламидии и затрудняет диагностику.

Изменения иммунного статуса. В настоящее время доказано, что при хламидиозе начинают развиваться следующие защитные иммунологические реакции:

–локальное образование секреторного иммуноглобулина А;

–цитотоксическая защита посредством Т-лимфоцитов;

–образование антител классов IgM, IgA, IgG к хламидийному липополисахаридному антигену.

Изменения показателей иммунитета системы при острых хламидийных цервицитах, как правило, неотчетливы. При хронизации и распространении процесса (сальпингит) они приобретают стойкий характер.

В общем анализе крови отмечается снижение уровня нейтрофилов и повышение содержания эозинофилов. При исследовании клеточного звена иммунитета непрямым иммунофлюоресцентным методом с помощью моноклональных антител, определении концентрации IgG A,M методом радиальной иммунодиффузии могут выявляться следующие нарушения: в гуморальном звене – снижение IgG и IgA при снижении относительного содержания клеток СД 72 (В-лимфоцитов). Дисбаланс клеточного звена иммунитета выражается в достоверном снижении клеток СД4 (относительное содержание), тенденции к повышению СД8, очевидно, за счет роста цитотоксических клеток и, как следствие, снижение иммунорегуляторного индекса. Факторы неспецифического иммунитета характеризуются значительным повышением относительного содержания популяции естественных киллеров, а также недостаточной функциональной активностью фагоцитарной системы.

Для акушера – гинеколога знание иммунологических нарушений необходимо для обоснованного назначения иммуномодулирующих препаратов, в частности, оказывающих стимулирующее действие на нейтрофильно-фагоцитарное и Т-клеточное звено иммунитета. Необходимо осуществлять индивидуальный подбор иммуномодуляторов на основании изучения функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов системы фагоцитоза методом люминолзависимой хемолюминесценции (ЛЗХЛ). Основанием для назначения того или иного препарата является максимальное по сравнению с другими повышение активности фагоцитов, детектируемое амплитудой вспышки ЛЗХЛ в момент внесения данного препарата в исследуемую пробу крови.

Чувствительность к антибиотикам. Проницаемость клеточных мембран для большинства антибиотиков низкая, их концентрация внутри клетки не достигает того уровня, который создается в крови. Латентность и тенденция к внезапному проявлению свежих поражений характерны для хламидийной инфекции как до лечения, так и после него за счет сохранения жизнеспособных элементов хламидий внутри эпителиальных клеток аналогично тому, как они сохраняются в культуре клеток, подвергнутой действию антибиотика. После нескольких пассажей на свежих клеточных культурах снова появляются внутриклеточные включения из сохранившихся жизнеспособных телец. Персистирование хламидий в организме у части больных в течение ряда лет, несмотря на проведенное лечение, свидетельствует о том, что у разных больных курсы лечения антибиотиками дают разные результаты, в особенности при осложненных формах. Применяются тетрациклины, макролиды, фторхинолоны.


1.2.Neisseria gonorrhoeae


Морфологические особенности. Neisseria gonorrhoeae – диплококки, напоминающие по форме кофейные зерна или бобы, прилегающие друг к другу уплощенными сторонами. Для них характерно наличие капсулы, а также пилей и ворсинок, облегчающих адгезию к эпителию. Субстрат для колонизации этим микробом – эпителий уретры, прямой кишки, конъюнктивы глаза, глотки, шейки матки, маточных труб и яичника. Они обладают полиморфизмом, образуют L-формы, хорошо красятся метиленовым синим или бриллиантовым зелёным. При антибиотикотерапии, хронической гонорее и в некоторых других случаях как морфологические признаки, так и отношение к окраске по Граму может изменяться.

Культуральные свойства. Очень прихотливы к условиям культивирования и питательным средам. Для выращивания гонококков требуются среды с кровью, сывороткой крови или асцитической жидкостью человека. Оптимальная температура +37

о

2

Биохимические свойства. Гонококки ферментируют только глюкозу с образованием кислоты без газа. Изменённые формы, в том числе L-формы, могут вообще не ферментировать углеводы. Протеолитическую активность не проявляют, аммиак, сероводород и индол не образуют, не приводят к гемолизу на средах, содержащих кровь. Штаммы гонококкоа, вызывающие диссеминированные инфекции, нуждаются в аргинине, гипоксантине и урациле (так называемые AHU+ штаммы). Бактерии отличает устойчивость к бактерицидному действию сывороточных IgM и IgG, а также комплемента.

Антигенная структура очень изменчива: характерны фазовые вариации (исчезновение антигенных детерминант) и антигенные вариации (изменение антигенных детерминант). Основную антигенную нагрузку несут детерминанты пилей и поверхностных белков. По наличию пилей гонококки разделяются на пять типов (Т1-Т5): типы Т1 и Т2 снабжены пилями (Р+ и Р++), окружены капсулой и вирулентны, бактерии прочих типов авирулентны. Белок I составляет до 60% вещества клеточной мембраны и его идентификация составляет основу серотипирования гонококков и распознавания бактерий методом ИФА. Белок II определяет специфические клинические проявления заболевания. Бактерии содержащие белки I и II обычно выделяют при поражениях мочевыводящих путей, а штаммы, содержащие белок I, но лишённые белка II – при диссеминированных поражениях. С высокой антигенной изменчивостью связано отсутствие иммунной защиты против повторного заражения. Наибольшее антигенное родство – с менингококками.

Факторы патогенности. Основными факторами являются пили, с помощью которых гонококки осуществляют адгезию и колонизацию эпителиальных клеток слизистой оболочки мочеполовых путей, и липополисахарид (эндотоксин, освобождающийся при разрушении гонококков). Гонококки синтезируют IgA – протеазу, расщепляющую IgA. Характерна генетическая изменчивость, даже на протяжении жизни одной микробной популяции. Передача информации осуществляется преимущественно конъюгацией. Выявлены F- и R- плазмиды, в т.ч. плазмиды, несущие ген бета – лактамазы.

Краткая эпидемиологическая характеристика. Источник гонореи – больной человек часто с малосимптомными или хроническими формами или гонококконоситель. Основной путь заражения гонореей – половой, возможно инфицирование плода при прохождении через родовые пути матери. При орогенитальных контактах может быть поражение глотки, миндалин, слизистой рта. Возможны супер – и реинфекции.

По данным ВОЗ, ежегодно в мире регистрируют до 200 млн вновь заболевших гонореей. В России после некоторого снижения заболеваемости в 90-е годы ХХ столетия вновь отмечено увеличение количества больных до 102,2 на 100 тыс. населения. Общепризнано, что заболеваемость населения, по крайней мере, в 2 раза выше официально зарегистрированной, поскольку гонорея протекает бессимптомно у 3-5% инфицированных, а также в статистические отчеты могут не попадать случаи заболевания, зарегистрированные в коммерческих центрах и пропущенные при нарушении алгоритма лабораторной диагностики.

Социальная значимость гонореи определяется не только ее частотой, но и последствиями, которые она вызывает, и в первую очередь бесплодием. Число больных достигает максимума в летне-осенний период (июль, август, сентябрь), соотношение больных гонореей мужчин и женщин составляет 1,5:2,0. Возросла заболеваемость гонореей среди молодежи в возрасте 15-19 лет. Чаще стали встречаться ассоциированные инфекционные поражения мочеполового тракта (29-80%), гонорейные поражения прямой кишки (наблюдаются у 35-40% женщин), слизистых оболочек рта и глотки (регистрируются у 45-95% женщин, имеющих орогенитальные контакты).

В случаях одновременного заражения гонореей и другими инфекциями удлиняется инкубационный период гонореи, изменяется клиническое течение заболевания и затрудняется клиническая и лабораторная диагностика.

Назад Дальше