через 10 минут экспозиции 20 % из них становились отрицательными.
Микроскопическое исследование окрашенного препарата не требует немедленного просмотра препарата, позволяет лучше изучить как морфологию трихомонад, так и другие элементы. Однако метод менее чувствителен и специфичен, а также более трудоемок. Частота обнаружения трихомонад в клинических материалах, полученных от пациентов с трихомониазом, помещенных на предметное стекло и окрашенных анилиновыми красителями, может составлять 30–62%. В препаратах, окрашенных по Граму, Лейшману, Романовскому–Гимзе, метиленовым синим по Леффлеру T. Vaginalis не всегда выявляется в типичной грушевидной форме. Во время фиксации и окрашивания препаратов трихомонады теряют свои морфологические особенности, что приводит к диагностическим ошибкам при микроскопическом исследовании. Чувствительность этого метода не превышает 60 %, специфичность – 95%.
Метод люминесцентной микроскопии при окрашивании препаратов акридиновым оранжевым используется редко. Также предложен метод окраски трихомонад по Филду, позволяющий различать живых и погибших паразитов с выявлением характерной ультраструктуры возбудителя.
В нашей стране диагностика трихомониаза осуществляется преимущественно методом микроскопического исследования окрашенных препаратов (в основном, метиленовым синим и по методу Грама), диагностические характеристики которого невысоки.
Культуральный метод с применением жидких или полужидких питательных сред в настоящее время считается «золотым стандартом» диагностики трихомониаза. К достоинствам культурального метода следует отнести его высокую специфичность (100 % при условии выявления активно подвижных трихомонад) и низкий порог чувствительности, составляющий от 10 паразитов/мл до 300–500 паразитов/мл образца, который во многом определяется качеством используемых питательных сред. Чувствительность культурального метода по сравнению с МАНК варьируется от 35 % до 96 %, в зависимости от качества транспортных и культуральных питательных сред и условий культивирования. Метод не лишен некоторых ограничений, таких как трудоемкость и длительный срок культивирования (от 2 до 7 дней с ежедневным микроскопическим исследованием), высокие требования к условиям транспортировки и хранения клинических образцов. Контаминация проб микроорганизмами может потребовать дополнительных пассажей, увеличивающих срок и стоимость исследования. Пассаж (пересев) через 2–3 дня культивирования снижает бактериальную контаминацию и может потребоваться для окончательной идентификации T. vaginalis. Трихомонады способны вступать в медленную фазу роста, и даже в чистой культуре иногда может наблюдаться задержка роста от 24 до 48 часов, прежде чем проявится характерный рост организма.
Трихомонады относят к факультативным анаэробам, они аэротолерантны, при их культивировании предпочтительны микроаэрофильные условия. Исследования качества различных сред показали, что к числу самых оптимальных относятся среды Hollander, Diamond-modified и СPLM, с чувствительностью до 96 %; однако, вышеперечисленные питательные среды отличаются высокой стоимостью.
Метод с использованием клеточных культур, в частности клеток линии McCoy, способен определять T. vaginalis в концентрациях менее 3 организмов в 1 мл вагинального отделяемого. В опытах in vitro показано, что T. vaginalis тропны к клеткам эпителия влагалища, по сравнению с другими типами клеток. Однако выделение трихомонад в культуре клеток – это не простой рутинный метод, он дорогой и трудоемкий.
Очевидно, оправданным можно считать опыт ряда зарубежных стран
(Англия и другие), где практикуется одновременное проведение микроскопического и культурального исследования материала при клинико-лабораторном обследовании пациента с подозрением на хламидийный цервицит и вагинит, что повышает качество диагностики и сокращает сроки обследования.
Иммунологические методы
Ограничения микроскопического и культурального методов исследования оказали стимулирующее влияние на внедрение альтернативных методов диагностики трихомониаза. К их числу относятся иммунологические методы, как для выявления антигенов T. vaginalis, так и для выявления антитрихомонадных антител.
Среди серологических тестов для определения антител к T. vaginalis в настоящее время безусловным лидером как по диагностическим характеристикам, так и по простоте исполнения, является иммуноферментный анализ (ИФА). В работе таких систем имеется ряд недостатков, обусловленных зависимостью иммунного ответа от различных факторов, характеристиками тест-систем, свойствами возбудителя. Чувствительность этих тестов составляет в среднем 82%, специфичность – 73%.
Поскольку антитрихомонадные антитела могут циркулировать в сыворотке крови в течение длительного времени после лечения, то дифференцировать таким образом текущую и перенесенную ранее инфекцию проблематично. Отсутствие адекватной модели с использованием лабораторных животных для исследования иммунного ответа при трихомониазе является серьезным ограничением для изучения возможностей серологического метода. Установлена корреляции наличия антитрихомонадных антител и онкологической патологии.
Для выявления антигенов T. vaginalis разработано несколько тестов. Как правило, чувствительность тестов для выявления антигенов трихомонад выше, чем чувствительность микроскопического метода исследования «нативного» препарата, но уступает (или сопоставима с ней) чувствительности культурального метода исследования. Бесспорным преимуществом данных тестов, по сравнению с традиционными методами диагностики трихомониаза, является то, что для интерпретации результатов исследования
не нужны живые трихомонады.
Прямое определение специфических белков T. vaginalis, таких как клеточный разъединяющий фактор (cell-detaching factor, СDF) и цистеин-протеаза (cysteine protease), являющихся иммуногенами всех наблюдавшихся
изолятов T. vaginalis, с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомониаза показало результаты, аналогичные результатам метода микроскопии «нативного» препарата. Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ выявления антигенов трихомонад в клинических материалах, полученных из влагалища, с использованием коммерческих тест-систем Trichomonas, использующий смесь меченных перокидазой и флюорохромом моноклональных антител к различным структурам T. vaginalis, показали аналитические характеристики, сравнимые с культуральным методом. Достоинством данного теста является также то, что результаты тестирования становятся доступны в течение одного часа.T. vaginalis может быть обнаружена методом прямой иммунофлюоресценции в отделяемом влагалища, а также иммунопероксидазным методом при цитологическом исследовании фиксированных цервикальных проб. Данные методы имеют достаточно высокую чувствительность (79– 90%) и специфичность (98–100 %) по сравнению с культуральным методом. Недостатком иммунологических методов является то, что для их выполнения требуются специальное оборудование; кроме того, эти методы достаточно дороги.
Для детекции T. vaginalis существует ряд методов определения их антигенов и предназначены для женщин с клиническими симптомами, что делает их неинформативными для других пациентов. Последнее поколение данных тестов – быстрый тест для выявления трихомонад.
В отечественной клинической практике пока «вспомогательными» остаются иммунологические и молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики влагалищных трихомонад, направленные на выявление либо видоспецифичных антигенных маркеров T. vaginalis (экспресс-тест), либо консервативных нуклеотидных последовательностей, характерных для T. vaginalis (например, часть гена бета-тубулина, повторяющийся фрагмент TV-E650 и др.), и отличающих их от иных простейших и других частых «сателлитных» возбудителей ИППП – Chlamуdia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis (с применением ПЦР- и ЛЦР-технологий).
ПЦР-тестирование (при условии использования высокоспецифичных и качественных праймеров) сегодня является, пожалуй, единственным надежным способом видовой дифференциации T. vaginalis от трихомонад других видов (T. tenax, T. hominis), которые в связи с изменением в последнее время стереотипов сексуального поведения (промискуитет, гомосексуальные, орально-генитальные и анально-генитальные контакты) могут быть обнаружены в образцах из урогенитального тракта, ротовой полости или прямой кишки. Несмотря на свой высокий диагностический потенциал, ПЦР-типирование T. vaginalis по нормативным документам пока не относится к категории арбитражных методов.
Получение клинических образцов. Для выявления T. vaginalis у женщин наиболее подходит материал из влагалища. Мазок с заднего свода берут дакроновым или вискозным тампоном на пластиковом стержне. Ватные тампоны на деревянных стержнях подходят для микроскопии и инокуляции в культуру, но не подходят для экспресс-тестов и МАНК. Поэтому, чтобы не путаться, рекомендовано не применять зонды с ватой. Производить забор материала пациентки могут самостоятельно, либо это могут делать врачи до размещения влагалищного зеркала в ходе гинекологического осмотра.
Также для МАНК на T. vaginalis подходит материал (из влагалища, шейки матки, моча), оставшийся при сборе анализов на хламидии или гонококки.
Чувствительность к химиопрепаратам. Редко встречаются, но описаны изоляты T. vaginalis с пониженной чувствительностью и резистентностью к метронидазолу (который обычно выступает первой линией терапии) и тинидазолу (вторая линия терапии). Тем не менее, в некоторых популяциях резистентность к метронидазолу обнаруживают в 2-5% случаев трихомониаза у женщин.
Оппортунистические инфекции
Особенности оппортунистических инфекций – полиэтиологичность, полиорганность, склонность к генерализации процесса, малая специфичность клинических проявлений. В их развитии играют роль как экзогенные возбудители (микоплазмы и др.), так и представители резидентной микрофлоры (эндогенные микроорганизмы), а также состояние иммунной системы организма.
Основными формами оппортунистических инфекций являются: гнойно – воспалительные процессы, бактеремия, сепсис, бактериальный эндотоксический шок, дисбактериозы (дисмикробиоценозы – дисбиозы).
Если патогенные микроорганизмы вызывают классические инфекции, то условно – патогенные микроорганизмы вызывают инфекции у лиц с нарушениями иммунного статуса (оппортунистические инфекции). В зависимости от этиологии и патогенеза иммунодефицита манифестируют различные инфекции и инвазии. При дефиците гуморального иммунитета преоб-ладают бактериальные инфекции, при преимущественном клеточном иммунодефиците – вирусные, протозойные и грибковые.
В современной патологии человека предполагается этиологическая роль около 100 видов условно-патогенных микроорганизмов. Основное значение среди них имеют представители следующих родов: Staphylococcus, Streptococcus, Peptostreptococcus, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Acinetobacter, Bacteroides, Bacillus, Mycobacterium, Mycoplasma, Candida, Cryptococcus, Pneumocysta.
На модели СПИД из большого числа известных оппортунистических инфекций установлен стандартный перечень 13 оппортунистических (иммунодефицит – индикаторных) инфекций, вызываемых простейшими (Toxoplasma gondii, Isospora belli, Cryptosporidium spp.), грибами (Pneumocystis carinii отнесены к бластомицетам – почкующимся дрожжеподобным грибам; Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis), бактериями (Salmonella spp., Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex), вирусами (Herpes simplex, Cytomegalovirus hominis). По данным многих авторов, примерно у половины больных СПИДом в клинике доминирует пневмоцистная пневмония, у четверти – саркома Капоши (предположительно вызывается вирусом герпеса человека 8 типа – ВГЧ8), часто проявляются инфекции, вызываемые различными герпес- вирусами, кандидоз.
Таким образом, если при клинике цервицита определяется микст – инфекция, в том числе кандидозная, герпетическая, микобактериальная, то естественным будет суждение врача о том, что цервицит протекает в организме с выраженным иммунодефицитом. При этом обращает на себя внимание крайняя таксономическая разнородность инвазий (вирусы, бактерии, грибы) и двуликость форм инфекционного процесса – латентное бессимптомное течение (чаще при улучшении иммунного статуса) или склонность к распространению (при прогрессировании иммунодефицита, например, при беременности).
Развитие и течение оппортунистических инфекций (лат.opportunas – склонный к заболеванию) определяются тремя группами факторов: свойствами возбудителя, состоянием макроорганизма и внешней среды. Со стороны возбудителя решающее значение в возникновении инфекции имеет высокая и гетерогенная по патогенности инфицирующая доза возбудителя и наличие у него определенного набора факторов вирулентности. Со стороны организма человека – нарушение целостности покровов и, что наиболее существенно, иммунодефицитные состояния. Значение окружающей среды связано с наличием факторов передачи возбудителя от инфицированного человека не инфицированному.
Возбудители оппортунистических инфекций не имеют строго выраженного органного тропизма, вследствие чего один и тот же вид может вызвать различные нозологические формы. В свою очередь одна и та же нозологическая форма заболевания (пневмония, сепсис и др.) может быть вызвана любым условно-патогенным микроорганизмом.
Оппортунистические инфекции часто вызываются ассоциацией микроорганизмов. Смешанные, или микст-инфекции, возникают в результате одновременного, а чаще последовательного заражения человека несколькими видами возбудителей.
Клиническая картина оппортунистических инфекций малоспецифична. Она зависит в большей мере от локализации поражения, чем от вида возбудителя. Для этих инфекций характерно хроническое течение. В основе хронизации лежит иммунодефицит, а также смена вариантного или видового состава возбудителей в течение болезни.
Эти же факторы обусловливают склонность оппортунистических инфекций к генерализации, развитию септикопиемии.
К особенностям оппортунистических инфекций относится так же сложность лечения, которая связана с множественной устойчивостью возбудителей к антимикробным препаратам, недостаточной активностью факторов неспецифической защиты, а также слабым иммунным ответом организма больного на антигены возбудителя. В связи с этим главным принципом лечения оппортунистических инфекций является сочетанное применение препаратов микробицидного действия и иммуностимулирующей терапии. Вместе с тем оппортунистические инфекции отличаются от заболеваний, вызванных облигатно-патогенными микроорганизмами, такими эпидемиологическими особенностями, как широкое распространение в больничных стационарах, частые случаи эндогенной инфекции.